血清spHBV及PIVKA-Ⅱ聯合檢測對HBV所致肝癌的預測價值

李飛 郭振添 莫海興 丁愛嬌 張拔山

異常凝血酶原-Ⅱ (PIVKA-Ⅱ )是HCC早期篩查較好的腫瘤標志物，但對于早期HCC的篩查而言，血清PIVKA-Ⅱ診斷的靈敏度和特異度不盡如人意[1-3]。為了增加HCC早期篩查診斷的靈敏度和特異度，我們引用新的血清標志物HBV基因組剪接變異體(Spliced variants of hepatitis B virus genomes, spHBV)，spHBV可反式激活乙肝自身以及宿主細胞內的某些基因(例如乙肝多種病毒啟動子，原癌基因等)，從而加快了慢性乙型肝炎發展為肝癌的進程[4-5]。因此，本次研究旨在對血清spHBV及PIVKA-Ⅱ對HCC的診斷預測價值進行討論，探究血清spHBV及PIVKA-Ⅱ檢測HCC的預測價值。

資料與方法

一、實驗對象及標本采集

本實驗選取2018年1月1日至2018年12月31日在東莞市人民醫院接受治療的原發性肝癌(肝癌組)和慢性乙型肝炎(非肝癌組)患者各46例。納入標準：肝癌組：首先需要是乙肝攜帶者，原發性肝癌(HCC) 的診斷標準需要均符合《原發性肝癌診療規范(2017 版)》，然后再依據病理學診斷，納入原發性肝癌患者。非肝癌組：慢性乙型肝炎的診斷標準需要符合《感染病學(第九版)》，還需要結合上腹部CT或MRI的影像結果確定無肝癌。排除標準：排除其他病毒感染的肝臟疾病，例如甲肝，丙肝等；或由其他病因引起，例如酒精性肝臟疾病、代謝性肝臟疾病；或者由于黃曲霉素引起的肝病，并且也要排除其他系統引起的惡性腫瘤等。因維生素K和華法林等會影響血清中PIVKA-Ⅱ的含量，所以正在使用這2種藥物的研究對象的標本予以剔除。本研究獲東莞市人民醫院倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同書。取研究對象血清5ml，無抗凝劑真空管收集，-80℃液氮冰箱保存。

二、實驗方法

血清spHBV DNA和wtHBV DNA濃度檢測實驗儀器ABI7600熒光定量PCR分析儀, 血清PIVKA-Ⅱ濃度水平檢測使用儀器雅培I2 000。熒光定量PCR(Real Time Quantitative-PCR, qRT-PCR)檢測血清spHBV和wtHBV基因，按照DNA提取試劑盒(達安基因公司)說明書提取收集標本中的DNA。 spHBV和wtHBV基因應用Oligo 7軟件(Molecμlar Biology Insights，Inc.Co，USA)設計引物，委托上海Invitrogen英濰捷基公司合成，相關基因的引物序列見表1。應用ABI7 600熒光定量PCR分析儀分別檢測血清標本spHBV DNA和wtHBV DNA，PCR擴增體系為： 10 μL PCR mastermix(1 mmolL)，上下游引物各0.4 μL(20 μmolL)，2 μL 模板cDNA，7.2 μL 去離子水補足至20 μL。PCR擴增先經預變性95℃10 min，然后進入50個擴增循環：95℃變性10 s，55℃退火30 s，72℃延伸60 s，最后72℃延伸10 min。血清spHBV即通過(spHBVDNA/wtHBVDNA)*100%來表示，所有實驗重復3次。

表1 PCR引物序列

三、統計學方法

本實驗使用統計軟件SPSS 23.0進行數據分析，Kolmogorov-Smirnov檢驗數據的正態分布情況，發現數據均呈偏態分布。用中位數(四分位間距)表示各組間spHBV及PIVKA-Ⅱ數值，計數資料使用百分比“%”表示，采用兩獨立樣本非參數Mann-Whitney U檢驗比較兩組間血清spHBV及PIVKA-Ⅱ水平。并且通過ROC曲線計算其AUC以進行診斷效能評價，并確定血清spHBV及 PIVKA-Ⅱ的最佳臨界值，同時計算血清spHBV及PIVKA-Ⅱ的的診斷指標。血清spHBV及PIVKA-Ⅱ的相關性分析采用Pearson檢驗方法進行檢測。P<0.05為差異喲統計學意義。

結 果

一、肝癌和非肝癌兩組血清spHBV和PIVKA-Ⅱ檢測結果分析

肝癌和非肝癌兩組血清spHBV及PIVKA-Ⅱ結果分析：肝癌組兩檢測指標的檢測結果均超過非肝癌組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 血清spHBV及PIVKA-Ⅱ的檢測結果組間比較M(X25%，X75%)

二、ROC曲線分析及最佳臨界點確定

血清spHBV及PIVKA-Ⅱ單項檢測在肝癌患者診斷中最佳截點分別為11.66%、35.42mAuml。血清spHBV的ROC曲線下面積(AUC)為0.848,而血清PIVKA-Ⅱ的AUCW0.805，但兩者聯合檢測時其AUC為0.965遠遠高于單項檢測，如圖1。

圖1 血清spHBV及PIVKA-Ⅱ單項檢測及聯合檢測的ROC曲線

三、血清spHBV及PIVKA-II對原發性肝癌的診斷效果評價

本實驗依據ROC曲線確定其最佳截點，血清spHBV和PIVKA-II各自的陽性標準分別為spHBV≥11.66%，PIVKA-II ≥35.42mAU mL，血清spHBV的敏感度為74.20%，特異度高達為93.55%；而血清PIVKA-II的敏感度80.6%，特異度80.6%，見表3。聯合診斷(1)：是指本實驗檢測指標血清spHBV和PIVKA-II濃度水平均超過其最佳截點，即兩項檢測結果均陽性。聯合診斷(2)：是指本實驗檢測指標血清spHBV和PIVKA-II檢測結果只要有1項為陽性。

四、血清spHBV及PIVKA-II相關性分析

本次研究對該實驗的全部樣本，肝癌組標本以及非肝癌組標本分別作了spHBV和PIVKA-II相關性分析，實驗數據表明不管是本次研究的全部樣本，肝癌組樣本，還是非肝癌組樣本，各指標之間均無相關系(P>0.05)。

討 論

我國大約每年有14萬患者因原發性肝癌而死亡，慢性乙型肝炎感染大多數患者最終發展成為了肝細胞癌(HCC)，40%的HCC直接歸因于HBV[6]。乙型肝炎病毒相關原發性肝癌的危險因素有多種，例如HBV DNA陽性、年齡(≥40歲)等[7]。HCC的早期篩查診斷主要依賴于影像學檢查(超聲檢查、CT 檢查、磁共振成像)、肝穿刺和血清檢測項目(如AFP，PIVKA-II等)等。盡管血清AFP是篩查HCC最廣泛的腫瘤標志物，但其在急性肝炎患者以及慢性肝炎急性發作時亦會有升高。相關研究發現血清AFP對HCC診斷的敏感性一般為56%～70%[3,8-11]，其特異性也不高。近年來，大量研究發現血清PIVKA-Ⅱ對原發性肝癌具有較好的輔助診斷價值[1-3,12-14]。本研究中血清PIVKA-II的敏感度和特異度為80.60%和80.60%， 單獨檢測PIVKA-II用于診斷原發性肝癌的結果并不理想。

spHBV目前發現有14種HBV基因組剪接變異體，而本次設計的引物主要用來擴增其中3種spHBV，即sp1、sp2、sp4。國外相關文獻報道：在慢乙肝感染期間常伴HBV基因發生剪接變異，其中有超過80%的乙肝患者均會出現這種情況，并且在確診為HCC之前即可觀察到spHBV升高。spHBV隨時間的推移而發生顯著變化，在發展成肝癌之前，spHBV水平每年以0.1%遞增[15]。

本研究對血清spHBV及PIVKA-II對原發性肝癌的預測價值進行了探究，本次研究數據表明，肝癌組其血清spHBV及PIVKA-II濃度水平顯著高于非肝癌組。當血清spHBV的診斷截點設為11.66%時，其診斷特異性可以提高到93.55%，其特異度遠遠超過血清PIVKA-II，其敏感性卻不如血清PIVKA-II(80.60%)。如按聯合診斷(1)的診斷方法診斷HCC，其診斷特異度和陰性預測值高達100%；若按聯合診斷(2)的診斷方法診斷HCC，其診斷的靈敏度和陽性預測值高達96.77%及96.00%，其正確指數高達74.19%，同兩者單獨檢測相比較都高。本實驗結果顯示，spHBV及PIVKA-II單一診斷HCC其漏診率較高，而兩者聯合診斷AUC高達0.965，比血清spHBV及PIVKA-II單個診斷HCC的診斷效能更優。兩檢測指標進行并聯診斷時，可明顯提高敏感度及陽性預測值，更有利于HCC的早期篩查和診斷。由此可見，為了減低HCC的漏診率，減少患者的誤診，推薦使用血清spHBV 聯合血清AFP進行檢測，這樣便可顯著提高早期肝癌患者篩查陽性率，從而減少肝癌患者的漏診，具有更好的預測價值。

表3 血清spHBV及PIVKA-II單獨和聯合診斷的評價指標(%)

綜上所述，血清spHBV聯合血清PIVKA-II檢測，可明顯增加肝癌早期篩查的陽性率以及檢出率，顯著提高敏感性，也明顯優化了其診斷效能。這可為HCC的早期篩查診斷提供充分的理論依據。然而本研究選取的樣本只有92例，相對而言標本數量不夠多，并未對所有標本觀察調研很長一段時間，并未對現今報道的14種spHBV 進行全面檢測，而只是選擇了其中比較常見的三種剪接變異體進行檢測，spHBV在HCC中作用機制及在慢性乙型肝炎的表達需進一步研究。