Th17和Treg細胞在慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者外周血中的表達及臨床價值

曾丹 王衛政

乙型肝炎病毒感染可誘發急或慢性肝炎、肝硬化、慢加急性肝衰竭等，是引起終末期肝病的關鍵原因，其分子機制尚不明確[1]。有資料顯示，宿主免疫反應在肝臟組織損傷進展中起著重要作用，尤其是輔助T細胞17(T helper cell 17，Th17)和調節性T細胞(Regulatory T cells，Treg)，Th17/Treg比例失衡可能與乙型肝炎病毒感染有關，但目前尚無二者診斷慢性乙型肝炎患者慢加急性肝衰竭風險的報道[2]。基于此，本文分析上述對象Th17、Treg、Th17/Treg表達水平，旨在探討Th17、Treg在慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者外周血中的表達及臨床意義，為患者病情進展及預后評估提供輔助手段，報道如下。

資料與方法

一、 一般資料

納入2016年10月至2018年10月于我院收治的65例慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者為合并肝衰竭組，另選取同期收治的40例單純慢性乙型肝炎患者和40例健康體檢者，分別設為單純慢性乙型肝炎組和正常對照組，所有對象均對本研究知情，且簽署同意書，獲我院醫學倫理委員會批準。納入標準：(1)慢性乙型肝炎：與《慢性乙型肝炎防治指南(2010年版)》[3]中慢性乙型肝炎診斷標準相符，均經肝穿刺組織等檢查確診，血清總膽紅素為171μmol/L及以上，國際標準化比率為1.5及以上(凝血酶原活動度為40%及以下)；年齡>18歲；(2)慢加急性乙型肝炎肝衰竭：參考《肝衰竭診治指南(2012年版)》[4]，均處于中期，極度乏力，伴嚴重消化道癥狀(如腹脹、嘔吐、厭食等)，黃疽進行性加深；存在出血傾向，凝血酶原活動度>20%且≤30%；伴肝性腦病(Ⅱ度以下)和(或)明顯腹水；年齡>18歲。排除標準：(1)合并甲、丙、戊型等肝炎病毒感染；(2)合并惡性腫瘤及心、腦、肺等嚴重原發疾病；(3)伴肝硬化、酒精性肝病、藥物性肝炎、自身免疫性肝病、遺傳代謝性肝病；(4)患者入組前6個月內行抗病毒及免疫調節治療、肝移植等；(5)精神疾患；(6)妊娠或哺乳期婦女。合并肝衰竭組65例患者中，男55例，女10例，年齡18～65(44.68±9.57)歲；單純慢性乙型肝炎組40例患者中，男32例，女8例，年齡18～63(43.57±8.96)歲；正常對照組中男33例，女7例，年齡20～67(45.12±9.10)歲。

二、方法

(一)Th17、Treg、Th17/Treg表達檢測 收集空腹外周靜脈血，以流式細胞儀(美國BD公司，FACS Calibur型)進行檢測。同時，計算Th17/Treg比例。

(二)生化指標檢測 采集空腹肘靜脈血3～5 mL，離心處理后取上層血清于-20 ℃條件下保存。以全自動生化分析儀(日本Olympus公司，Olympus AU2700型)，檢測丙氨酸氨基轉移酶、天門冬氨酸氨基轉移酶、總膽紅素，試劑由日本Olympus公司提供；以放射免疫法測定甲胎蛋白，試劑盒購自武漢明德生物科技股份有限公司。以全自動血凝分析儀(日本sysmex公司，CA7000型)測定凝血酶原時間，試劑由日本sysmex公司提供。

三、觀察指標

觀察三組Th17、Treg、Th17/Treg表達水平，并按慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者臨床轉歸情況，將其分為存活組和死亡組，并對比存活組和死亡組Th17、Treg、Th17/Treg表達水平。同時，分析合并肝衰竭組Th17、Treg、Th17/Treg表達水平與丙氨酸氨基轉移酶、天門冬氨酸氨基轉移酶、總膽紅素及凝血酶原時間、甲胎蛋白的相關性。慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者臨床轉歸判定標準[4]：住院期間，患者臨床癥狀減輕且穩定，總膽紅素低于171μmol/L，凝血酶原活動度高于40%，出院后隨訪3個月患者仍存活，即為存活組；住院期間，患者臨床癥狀并未減輕，總膽紅素為171μmol/L及以上，且凝血酶原活動度為40%及以下，出院后隨訪3個月患者死亡，歸為死亡組。

四、 統計學方法

結 果

一、 三組一般資料比較

三組性別、年齡比較差異無統計學意義(P>0.05)；合并肝衰竭組丙氨酸氨基轉移酶、天門冬氨酸氨基轉移酶、總膽紅素、凝血酶原時間、國際標準化比率、甲胎蛋白顯著高于單純慢性乙型肝炎組(P<0.05)，單純慢性乙型肝炎組上述指標均顯著高于單純慢性乙型肝炎組(P<0.05)，見表1。

二、三組Th17、Treg、Th17/Treg表達比較

合并肝衰竭組Th17、Th17/Treg表達顯著高于單純慢性乙型肝炎組和正常對照組(P<0.05)，單純慢性乙型肝炎組Th17表達顯著高于正常對照組(P<0.05)；合并肝衰竭組、單純慢性乙型肝炎組Treg表達雖明顯高于正常對照組，但比較差異均無統計學意義(P>0.05)，見表2。

三、存活組與死亡組Th17、Treg、Th17/Treg表達對比

65例慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者出院后隨訪3個月，發現死亡40例，存活25例。存活組Th17、Th17/Treg表達較死亡組顯著下降(P<0.05)，見表3。

四、Th17、Treg、Th17/Treg表達與甲胎蛋白、凝血酶原時間、肝功指標的相關性

經直線相關分析，結果顯示，Th17與丙氨酸氨基轉移酶、天門冬氨酸氨基轉移酶、凝血酶原時間呈正比例關系，Treg與凝血酶原時間呈負比例關系，Th17/Treg與丙氨酸氨基轉移酶、天門冬氨酸氨基轉移酶、甲胎蛋白呈正比例關系，見表4。

表1 三組一般資料比較[(±s)，n(%)]

注：與合并肝衰竭組比較，①P<0.05；與單純慢性乙型肝炎組比較，②P<0.05

表2 三組Th17、Treg、Th17/Treg表達比較(±s)

注：與合并肝衰竭組比較，①P<0.05；與單純慢性乙型肝炎組比較，②P<0.05

表3 存活組與死亡組Th17、Treg、Th17/Treg表達對比(±s)

表4 Th17、Treg、Th17/Treg與甲胎蛋白、凝血酶原時間、肝功指標的相關性

討 論

慢加急性乙型肝炎肝衰竭屬國內常見肝病死亡的原因之一，病情進展迅速，預后較差，與適應性免疫及天然免疫應答紊亂有關，多種細胞(T淋巴細胞、樹突狀細胞等)參與了該病的發生[5-6]。

本研究結果顯示，合并肝衰竭組、單純慢性乙型肝炎組Th17、Treg表達均明顯高于正常對照組，這與沈敏等[7]報道相似，證實Th17、Treg參與乙型肝炎病毒感染病理過程，而Treg表達升高可能會負反饋性調節Th17所致過度免疫應答，使乙型肝炎病毒特異性T細胞應答受阻，從而緩解肝臟炎性反應，預防疾病進一步加重。另外，本研究發現，合并肝衰竭組Th17/Treg表達明顯高于單純慢性乙型肝炎組和正常對照組，提示慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者機體出現Th17/Treg細胞分化失衡且更偏向于Th17，表明免疫功能亢進所致免疫病理損傷參與慢加急性乙型肝炎肝衰竭的發病。此外，本研究中，存活組Th17、Th17/Treg表達明顯低于死亡組，提示與存活患者相比，死亡患者機體內免疫反應更加劇烈。慢加急性乙型肝炎肝衰竭存活患者Treg細胞逐漸處于優勢地位，經誘導機體免疫應答受抑，可預防肝損害持續加重；而慢加急性乙型肝炎肝衰竭死亡患者機體內Th17/Treg細胞分化失衡加劇，以Th17細胞為主導，誘發持續免疫損傷，引起肝損害進行性加重，最后導致死亡。

本研究結果顯示，Th17表達與丙氨酸氨基轉移酶、天門冬氨酸氨基轉移酶、凝血酶原時間呈正相關，Treg表達與凝血酶原時間呈負相關，且Th17/Treg與丙氨酸氨基轉移酶、天門冬氨酸氨基轉移酶、甲胎蛋白呈正相關。慢性乙型肝炎演變為慢加急性乙型肝炎肝衰竭，與外周血中Th17、Treg表達有關，且反應肝臟炎癥嚴重性[8]。筆者推測，在慢加急性乙型肝炎肝衰竭發病過程中，促炎因子Th17高表達、Th17/Treg細胞分化失衡與肝細胞炎性壞死有關，證實Th17、Th17/Treg屬于肝臟炎性反應程度的靈敏指標，這與患者臨床表現(肝臟功能嚴重障礙，如合成、解毒、排泄、生物轉化等)相符。但本研究中，未發現總膽紅素與Th17、Treg、Th17/Treg的相關性，可能與樣本量偏少等因素有關。