法舒地爾復乳的制備及質量評價

李秀英，趙 婧，侯倩宜，高騰美，王穎莉

（山西中醫藥大學，山西 晉中030619）

法舒地爾是一種蛋白激酶抑制劑，其在正常或病理情況下都能競爭性結合Rho 激酶催化區的ATP 位點，阻斷Rho 激酶的活性。法舒地爾注射液在臨床中常用于蛛網膜下腔出血后腦血管痙攣等引起的缺血性腦血管疾病癥狀的改善。研究發現法舒地爾能改善動脈粥樣硬化患者的內皮功能，減少動脈粥樣斑塊，而且可以有效擴張血管，改善心力衰竭狀況，因此可以用于多種老年病的防治［1-2］。該類慢性病需長期治療，注射劑已不

能滿足臨床用藥需求，有必要開發更為適宜的口服制劑。復乳是一種良好的藥物載體，藥物被油膜包裹后可減少其在胃腸道的水解，降低副作用，增加吸收；并且具有一定的緩釋和靶向作用，可增強藥效，所以將復乳劑型應用于法舒地爾口服給藥是解決水溶性法舒地爾口服代謝快、絕對生物利用度低（10.2%）［3］的一種潛在制劑手段。

1 實驗材料

1.1 實驗儀器

Waters e2695 型高效液相色譜儀，2998 PDA檢測器，Agela Innoval C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），JA5003 分析天平（上海舜宇恒平科學儀器有限公司），78-1 型磁力加熱攪拌器（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司），TGL18M 冷凍超高速離心機（湖南湘立科學儀器有限公司），雷磁DDS-11C 型電導率儀（上海儀電科學儀器股份有限公司），CX22 奧林巴斯顯微鏡，Zetasizer 3000 馬爾文激光散射粒徑測定儀（英國馬爾文公司）。

1.2 實驗試藥

鹽酸法舒地爾（Ark pharm 公司，批號：WG0130021-160517001，含量98%），蛋黃卵磷脂（EPC，上海如吉生物科技發展有限公司，批號160116），維生素E 聚乙二醇琥珀酸酯（TPGS，上海譜振生物科技有限公司，批號ZY161029），蓖麻油（天津市耀華化學試劑有限責任公司），司班80（Span-80）、吐溫80（Tween 80）、磷酸二氫鉀溶液、氯仿（天津市科密歐化學試劑有限公司），乙腈、甲醇（色譜純，廣州艾欣科學儀器有限公司）。

2 方法與結果

2.1 法舒地爾分析方法學的建立

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Agela Innoval C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：0.05 mol/L 磷酸二氫鉀溶液（用1 mol/L 的氫氧化鈉調節pH 至5.0）-甲醇=84∶16；流速：1.0 mL/min；檢測波長：218 nm；進樣量：20 μL［4］。

2.1.2 法舒地爾復乳供試品溶液制備 精密稱定法舒地爾復乳1.0 g，流動相超聲溶解后定容至10 mL，過濾，取續濾液2 mL 以流動相稀釋至10 mL，成為每毫升含0.02 g 的供試品溶液備用。

2.1.3 空白復乳供試品溶液制備 按照空白復乳的制備工藝，制備不含法舒地爾的空白復乳，并用2.1.2 項下方法制得相應的空白復乳供試品溶液。

2.1.4 法舒地爾系列標準溶液的配制 精密稱取5.03 mg 法舒地爾原料藥，置于25 mL 錐形瓶中，用蒸餾水定容至刻度，使其完全溶解，即得200.12 μg/mL 法舒地爾母液。分別精密移取法舒地爾母液0.10 mL、0.25 mL、0.50 mL、1.00 mL、2.50 mL、5.00 mL 置10 mL 容量瓶中，用流動相定容至刻度，搖勻，即可得到1.00 μg/mL、2.00 μg/mL、5.00 μg/mL、10.01 μg/mL、20.01 μg/mL、50.03 μg/mL、100.06 μg/mL 法舒地爾系列標準溶液，過0.45 μm 微孔濾膜，濾過，取續濾液，即得。

2.1.5 系統適應性 精密吸取標準品、空白復乳及法舒地爾復乳供試液各20 μL，按照上述“2.1.1”色譜條件進樣分析。法舒地爾色譜峰出現在5.7 min，空白復乳在相應保留時間無色譜峰，因此空白復乳對法舒地爾無干擾。色譜圖見圖1。

圖1 HPLC 色譜圖

2.1.6 線性關系考察 精密吸取上述法舒地爾系列標準溶液20 μL，按照上述色譜條件，測得峰面積（A），計算回歸方程A=71 098C-21 802，r=0.999 9，法舒地爾在1.00～100.06 μg/mL 范圍內線性關系良好。

2.1.7 精密度實驗 精密吸取上述標準溶液（10.01 μg/mL）20 μL，按照上述色譜條件，連續進樣6 次，法舒地爾的峰面積平均值為（689 875±2561），RSD為0.37%，結果表明精密度較好。

2.1.8 穩定性實驗 取上述法舒地爾復乳供試液，分別于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h 按照上述色譜條件測定。法舒地爾峰面積平均值為（7 062 215±41 667），RSD為0.59%，結果表明供試品溶液在8 h 內穩定。

2.1.9 重復性實驗 取同批法舒地爾復乳，按供試品溶液制備方法制得6 份平行的供試品溶液，分別進樣，記錄色譜圖。測得的法舒地爾峰面積的RSD為1.18%，表明該方法重復性好。

2.1.10 回收率實驗 取6 份空白復乳，每份1.0 g，分別加入法舒地爾溶液（100.06 μg/mL）0.1 mL，渦旋混勻，按照供試品溶液制備方法操作，測定法舒地爾平均回收率為98.02%，RSD為1.31%。

2.1.11 離心保留率 將法舒地爾復乳置于EP管中，用蒸餾水稀釋10 倍，室溫下，于3000 r/min 低速離心30 min，吸取下清液，按照“2.1.1”利用高效液相法測定藥物含量，根據公式離心保留率＝1-W1/W（W1表示離心后未包封于內水相中的藥物量，W表示離心后未包封于內水相中的藥物量與仍包封于內水相中的藥物量之和即藥物總量），計算各處方的離心保留率［5］。

2.2 法舒地爾復乳的制備工藝與處方篩選

2.2.1 法舒地爾復乳的基本處方及制備工藝 采用兩步乳化法制備法舒地爾復乳。10 g 初乳組成為：以適量蓖麻油為油相，以法舒地爾水溶液為水相（其中含0.1 g 法舒地爾），以1.5 g 的Span 80與Tween 80 的混合物以及0.2 g 的TPGS 為混合乳化劑Ⅰ；復乳的組成為：采用上述制備的10 g 初乳為內相，以8.3 g 水為外水相，以1.5 g 的Tween 80與磷脂的混合物以及0.2 g 的TPGS 為混合乳化劑Ⅱ。在控溫下將乳化劑Ⅰ及法舒地爾（0.1 g）溶于水中制備內水相，于磁力攪拌器攪拌（8000 r/min）作用下將內水相緩緩加入油相中（蓖麻油），充分攪拌15 min 得W/O 型初乳。將乳化劑Ⅱ溶解于水中制備外水相，隨后在1000 r/min 攪拌條件下，將W/O 型初乳緩緩加入到外水相中，攪拌20 min，得W/O/W 型復乳。

2.2.2 處方篩選 選取初乳中蓖麻油與蒸餾水的質量比（A）、乳化劑I 中Span 80 與Tween 80 的質量比（B）、乳化劑II 中Tween 80 與卵磷脂的質量比（C）為考察因素，以離心保留率為評價指標，每個因素各取3 個水平，采用L9（34）進行正交實驗，因素水平見表1，正交試驗結果及方差分析結果見表2、表3。

表1 正交因素水平表

表2 L9（34）正交試驗及結果

表3 方差分析結果表

根據方差分析結果顯示，A、B、C 三個因素中，A、B 對離心保留率有顯著影響，且影響順序為A＞B＞C，正交試驗中離心保留率最高的組合為A2B2C3。直觀分析結果，由極差R 可以發現對脂質體包封率影響為A＞B＞C，得出最優處方為A2B2C3，與正交分析優選出的條件一致，為正交表中的實驗5，即蓖麻油與水質量比為2∶1，乳化劑I 中Span 80 與Tween 80 質量比為7∶3，乳化劑II 中Tween 80 與卵磷脂質量比為4∶1。

2.3 法舒地爾復乳的制備

按照“2.2.2”項下所得最優處方，稱取各成分，并按照“2.2.1”項下方法制備法舒地爾的復乳。具體為：在控溫下將乳化劑I（1.05 g Span 80、0.45 g Tween 80、0.2 g TPGS）及0.1 g 法舒地爾溶于2.73 g水中制備內水相，于8000 r/min 攪拌作用下將內水相緩緩加入5.47 g 蓖麻油中，充分攪拌15 min 得W/O 型初乳。將乳化劑Ⅱ（1.2 g Tween 80、0.3 g 卵磷脂、0.2 g TPGS）溶解于8.3 g 水中制備外水相，隨后在1000 r/min 攪拌條件下，將W/O 型初乳緩緩加入外水相中，攪拌20 min，得W/O/W 型復乳。

2.4 形態觀察

取少量復乳涂于載玻片，加少量水稀釋，涂勻后加蓋玻片，于光學顯微鏡下觀察，結果如圖2 所示。由圖2 可知，制備的法舒地爾復乳形態圓整、粒度均一。

2.5 粒度測定

圖2 法舒地爾復乳顯微形態觀察

使用馬爾文激光粒度儀測定法舒地爾復乳的粒徑。儀器的激光束波長設定為633 nm，入射光與散射光束的夾角為90°，測定溫度設定為25 ℃。取適量法舒地爾復乳經20 倍量稀釋后進行測定，測得復乳的粒徑分別為421.5 nm、345.1 nm、380.4 nm，平均粒徑為（382.3±38.2）nm。結果見圖3。

圖3 法舒地爾復乳粒徑圖

2.6 電導率測定

在室溫下，取適量法舒地爾復乳進行電導率的測定，測得復乳的電導率為419 μs/cm、427 μs/cm、437 μs/cm，平均電導率為（428±9.02）μs/cm。

2.7 載藥量測定

稱3 批法舒地爾復乳，按照“2.1.2”項下操作制備供試品溶液，按照高效液相色譜法進行含量檢測，測得法舒地爾復乳的載藥量分別為0.41%、0.54%、0.49%，平均載藥量為（0.48±0.06）%。

3 討 論

復乳的穩定性是復乳處方篩選的重要指標，而TPGS 藥物的作用除了作為乳化劑，還有提高穩定性的作用，抑制胃腸道藥物外排泵P-gp 的作用［6-7］。因TPGS 的價格相對較高，在滿足需求的情況下TPGS 的使用量達到最低。TPGS 溶液的制備采用薄膜水化法，稱取0.20 g TPGS 置于梨形瓶中，加入10 mL 氯仿溶解，利用旋轉蒸發器旋成膜，然后用相應體積的蒸餾水溶解［8-9］。

混合乳化劑比單一乳化劑更能提高復乳穩定性，Span 80 與Tween 80 乳化劑的結合能大大提高復乳的穩定性［10］。復乳制備中，第二步乳化應避免高速或長時間攪拌，否則油膜容易破裂，藥物包裹率會變低。