穿根藤抗炎成分車葉草苷的提取工藝研究

洪影雯　梁子寧　廖桂秀　韋麗翠　龍琪云

摘要：采用高效液相色譜法建立穿根藤（Psychotria serpens L.）車葉草苷含量測定的方法，以車葉草苷含量為指標，在甲醇溶液質量分數、料液比、提取時間單因素試驗的基礎上，結合正交試驗優化提取工藝。結果表明，車葉草苷的最佳提取工藝為70%甲醇溶液、料液比1∶60，提取時間30 min。

關鍵詞：穿根藤（Psychotria serpens L.）;車葉草苷;提取工藝

中圖分類號：TQ461? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2020）02-0141-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.02.031? ? ? ? ? ?開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Extraction technology of anti-inflammatory constituent

asperuloside from Psychotria serpens L.

HONG Ying-wen，LIANG Zi-ning，LIAO Gui-xiu，WEI Li-cui，LONG Qi-yun

（Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning 530001，China）

Abstract： HPLC was used to establish methods of content determi-nation of asperuloside in Psychotria serpens L.. Asperuloside as index components，on the basis of methanol concentration，liquid ratio and extraction time，we carried out experiments of single factor and orthogonal design to further optimize the extraction process. Optimum extraction of Glycyrrhizic flavonoids：70% methanol，solid-liquid ratio 1∶60，extraction time 30 min.

Key words： Psychotria serpens L.; asperuloside; extraction process

蔓九節（Psychotria serpens L.）又名穿根藤，為茜草科九節屬植物[1]。性平，味苦、辛，歸肝經，具有祛風濕，舒經活絡，消腫止痛等功效，主要治療風濕痹痛，腰肌勞損，坐骨神經痛，多發性癰腫，骨結核，跌打損傷，骨折，咽喉腫痛等癥，是廣西壯族民間常用草藥[1-3]，常用全株治療頭痛、小兒疳積。車葉草苷是穿根藤中主要的活性成分，是一種環烯醚萜苷類化合物[4]，分子式為C18H22O11。車葉草苷具有抗菌、抗氧化、抗誘變、抗腫瘤和抗炎鎮痛等藥理作用[5，6]。藥理研究表明，車葉草苷具體內外抗炎作用，其抗炎作用可能是通過抑制NF-кB的活化基因轉錄與蛋白表達，減少NO釋放有關;并且車葉草苷在小鼠急性肺損傷病變的治療中具有顯著作用[7，8]。車葉草苷發揮抗炎作用的同時還伴隨著鎮痛作用[9]。

本研究通過3種提取工藝（冷浸提取法、超聲提取法、回流提取法）的比較，以車葉草苷為指標，通過單因素試驗、正交試驗等對車葉草苷的提取工藝進行優化研究，為車葉草苷的開發和利用提供試驗依據。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 試驗材料? 穿根藤藥材分別采于廣西壯族自治區不同產地，經廣西中醫藥大學藥用植物教研室梁子寧教授鑒定其為茜草科植物蔓九節Psychotria serpens L.的全株。

1.1.2? 儀器與試劑? 1260系列高效液相色譜儀（包括G-1311C高壓四元泵，二極管陣列檢測器，1260series色譜工作站，美國安捷倫科技公司）。車葉草苷對照品（上海士鋒生物科技有限公司，批號18032716）。

1.2? 方法

1.2.1? 對照品的制備? 精密稱取車葉草苷對照品適量，加入甲醇溶液制成1 mL含0.623 mg的溶液，取上清液即得。

1.2.2? 供試品的制備? 取穿根藤粉末0.5 g，加70%甲醇溶液30 mL，超聲提取30 min，濾過蒸干，甲醇溶液溶解定容至10 mL容量瓶中，13 000 r/min離心10 min，取上清液，作為供試液。

1.2.3? 車葉草苷含量測定方法的建立

1）色譜條件。Agilent5TC-C18（2）色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈-0.1%磷酸（14∶86）為流動相，進樣量10 μL，檢測波長240 nm，柱溫25 ℃，流速0.8 mL/min。

2）標準曲線的制備。精密吸取上述車葉草苷對照品溶液（0.623 g/L）1 mL，分別置于1、5、10、25、50、100 mL容量瓶中，加甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，配制系列車葉草苷對照品溶液。分別吸取上述6個濃度的溶液10 μL，按選定的色譜條件測定峰面積，以峰面積（x）為縱坐標，對照品溶液濃度（g/L）為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程y=11 581.805 8x-59.339 292（r=0.999 73），線性范圍0.006 23～0.623 g/L。

1.2.4? 精密度試驗? 取同一車葉草苷對照品溶液（0.124 6 g/L），連續進樣6次，車葉草苷峰面積的RSD為0.99%，表明儀器精密度良好。

1.2.5? 穩定性試驗? 取穿根藤供試品溶液（CGT-1），于0、2、4、6、8、16、24 h分別進樣10 μL測定，車葉草苷峰面積RSD為1.49%，表明供試品溶液在24 h內基本穩定。

1.2.6? 重復性試驗? 稱取穿根藤藥材干燥粉末（CGT-1）0.5 g，共6份，精密稱定，測定并計算車葉草苷的含量，RSD為1.53%，表明該方法重復性良好。

1.2.7? 加樣回收率試驗? 精密稱定已準確進行含量測定的穿根藤藥材干燥粉末（CGT-1）0.25 g，共6份，置于具塞錐形瓶中，分別精密加入車葉草苷對照品溶液（0.623 g/L）1.0 mL，按“1.2.2”方法制備供試品溶液，按“1.2.3”色譜條件測定，計算得平均加樣回收率為100.72%，RSD為1.92%。

1.2.8? 車葉草苷的提取工藝單因素試驗

1）提取方法對車葉草苷提取率的影響。精密稱取0.5 g穿根藤粉末3份，采用超聲提取法、回流提取法、冷浸提取法對車葉草苷提取率進行工藝考察。

2）甲醇質量分數對車葉草苷提取率的影響。精密稱取0.5 g穿根藤干燥粉末4份，分別以30%、50%、70%、100%質量分數的甲醇作為提取溶劑，超聲提取1 h，過濾，蒸干，甲醇溶解定容至10 mL容量瓶中，進樣量10 μL，測定峰面積，計算車葉草苷的含量。

3）提取時間對車葉草苷提取率的影響。精密稱取0.5 g穿根藤粉末4份，在料液比為1∶50（g∶mL，下同），甲醇質量分數為100%的條件下分析提取時間分別為30、60、90、120 min時車葉草苷的提取率。

4）料液比對車葉草苷提取率的影響。精密稱取0.5 g穿根藤粉末3份，以甲醇溶液為提取溶劑，提取時間為1 h的情況下，考察料液比對車葉草苷提取率的影響，料液比為1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶100。

1.2.9? 正交試驗? 根據單因素試驗結果，采用L9（34）正交試驗表對甲醇溶液質量分數（A）、料液比（B）、提取時間（C）進行3因素3水平正交試驗，優化車葉草苷的最佳提取工藝，因素與水平如表1所示。

2? 結果與分析

2.1? 車葉草苷的提取工藝單因素試驗

2.1.1? 提取方法對車葉草苷提取的影響? 精密稱取0.5 g穿根藤粉末3份，采用超聲提取法、回流提取法、冷浸提取法對車葉草苷提取率進行工藝考察，結果見圖1。結果表明，冷浸和回流提取法的提取率比超聲提取率大，但超聲提取法成本較低、簡便易行，綜合考慮后選擇超聲提取法作為車葉草苷提取方法。

2.1.2? 甲醇溶液質量分數對車葉草苷提取的影響? 精密稱取0.5 g穿根藤干燥粉末4份，分別以30%、50%、70%、100%的甲醇溶液作為提取溶劑，超聲提取1 h。結果（圖2）表明，隨著甲醇溶液質量分數的增大，車葉草苷提取含量呈上升趨勢。

2.1.3? 提取時間對車葉草苷提取的影響? 精密稱取0.5 g穿根藤粉末4份，在料液比為1∶50，甲醇質量分數為100%的條件下分析提取時間分別為30、60、90、120 min時車葉草苷的提取含量。結果（圖3）表明，當提取時間在30～90 min時，車葉草苷的提取含量隨時間的增加而增加，當時間為90 min時提取含量最大，但當提取時間超過90 min后，隨著時間的增加，提取含量逐漸下降。

2.1.4? 料液比對車葉草苷提取的影響? 精密稱取0.5 g穿根藤粉末3份，以甲醇為提取溶劑，提取時間為1 h的情況下，考察料液比對車葉草苷提取含量的影響。料液比為1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶100。結果（圖4）表明，料液比從1∶30至1∶60呈上升趨勢，在1∶60達到最高，然后隨著提取液增加提取含量減小。

2.2? 車葉草苷的提取工藝正交優化

根據單因素試驗結果，采用L9（34）正交試驗對甲醇溶液質量分數（A）、料液比（B）、提取時間（C）進行3因素3水平正交試驗，優化車葉草苷的最佳提取工藝，試驗結果及統計分析見表2和表3。

以車葉草苷含量為指標，則影響程度依次為A>B>C。A、B因素對提取率有顯著影響，C因素無顯著影響。方差分析顯示R1>R2>R3。結果表明，提取溶液質量分數為最主要因素，料液比次之，提取時間的影響最小，最佳提取條件為A2B3C3，即甲醇溶液質量分數70%、料液比1∶60、提取時間90 min。

2.3? 車葉草苷提取的工藝驗證

為進一步確定最佳提取條件，對正交試驗分析得到的車葉草苷提取最佳的條件進行驗證性試驗，結果見表4。驗證試驗結果顯示，兩個不同提取條件下A2B3C3提取方法的車葉草苷含量稍大于A2B3C1，但總體差異不大，從節省時間、降低成本的角度考慮，綜合比較后確定最佳提取工藝為70%甲醇溶液、料液比1∶60、提取時間30 min。

3? 討論

穿根藤中主要成分有環烯醚萜苷類、黃酮類和三萜類成分，其中環烯醚萜苷類主要有車葉草苷。研究表明環烯醚萜苷類成分具有抗腫瘤和抗病毒、抗抑郁、抗炎鎮痛、抗阿爾海默病、抗休克、抗肥胖以及保護心血管等作用[10]。車葉草苷具有抗菌、抗氧化、抗誘變、抗腫瘤和抗炎鎮痛等藥理作用[11，12]。穿根藤具有的舒經活絡、祛風止痛等功效與車葉草苷的抗炎鎮痛、抗氧化和抗癌等作用相關。因此，本研究以車葉草苷含量為主要評價指標。車葉草苷作為穿根藤抗炎有效成分的作用機制則有待另文報道。

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收稿日期：2019-02-11

基金項目：廣西壯瑤藥重點實驗室項目（桂科基字[2014]32號）;廣西重點學科壯藥學項目（桂教科研[2013]16號）;壯瑤藥協同創新中心

項目（桂教科研[2013]20號）

作者簡介：洪影雯（1994-），女，廣西北海人，碩士，研究方向為中藥及民族藥品種、品質及資源開發，（電話）18376648556（電子信箱）

604217976@qq.com;通信作者，梁子寧，教授，碩士生導師，主要從事中藥及民族藥品種、品質及資源開發研究，（電話）18154515865

（電子信箱）381668307@qq.com。