培養管硅膠顯色法直接檢測結核菌吡嗪酰胺耐藥性

瞿梅 黃飛 陳俊林 顧德林 胡忠義 丁元生

【摘要】 目的：利用培養管硅膠顯色法直接檢測臨床涂陽痰標本中結核分枝桿菌（MTB）吡嗪酰胺（PZA）藥物敏感性，并對該方法進行臨床應用評價。方法：對2016年6月-2017年10月在南通市第六人民醫院就診的158例肺結核患者涂陽痰標本進行預處理，利用Bactec MGIT960與培養管硅膠顯色法同步進行PZA藥物敏感性檢測，并對檢測結果進行比較。結果：以Bactec MGIT960檢測PZA藥物敏感性結果為判斷標準，培養管硅膠顯色法靈敏度、特異性、符合率分別為96.8%、95.9%、96.7%。報告結果平均時間為（24.5±2.0）d，同Bactec MGIT960檢測時間相仿，報告時間與痰中MTB菌量及活力有相關性。結論：培養管硅膠顯色法可以替代Bactec MGIT960直接對臨床涂陽痰標本進行PZA藥物敏感性檢測，結果可靠，操作簡便，成本低廉，滿足臨床快速診斷的需要，適合推廣使用。

【關鍵詞】 結核分枝桿菌 吡嗪酰胺 藥物敏感性試驗 硅膠顯色法 Bactec MGIT960

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2020.03.026 文獻標識碼 B 文章編號 1674-6805（2020）03-00-04

[Abstract] Objective： Using Culture tube silica gel assay to directly detect Pyrazinamide （PZA） drug sensitivity of mycobacterium tuberculosis （MTB） in clinical specimens of sputum smear-positive， and to evaluate clinical application of this method. Method： A total of 158 cases sputum smear-positive samples of pulmonary tuberculosis patients from June 2016 to October 2017 in Nantong Sixth Peoples Hospital were pretreatmented， PZA drug sensitivity test were synchronous detected by Bactec MGIT960 and culture tube silica gel assay， and the test results were compared. Result： The results of PZA drug sensitivity by Bactec MGIT960 as the judgment standard， sensitivity， specificity and accuracy of culture tube silica gel assay were 96.8%， 95.9% and 96.7% respectively. The average time of report results was for （24.5±2.0） d， similar with Bactec MGIT960 testing time， report time were correlationsand with the number of MTB in sputum and dynamic. Conclusion： The culture tube silica gel assay can replace Bactec MGIT960 for directly detecting PZA resistance of MTB in smear-positive sputum， the result is reliable， simple operation， low cost. It can meet the need of rapid clinical diagnosis and worthy in application.

[Key words] Mycobacteriurn tuberculosis Pyrazinamide Drug susceptibility Culture tube silica gel assay Bactec MGIT960

First-authors address： Nantong Sixth Peoples Hospital， Nantong 226011， China

隨著醫學科學進步，結核病精準化治療已成為醫患雙方共同追求的目標，作為特異感染性疾病，為避免無效用藥，快速精準診斷患者感染的結核菌是否出現耐藥是制定有效治療方案的關鍵。相對于其他一線抗結核藥物能高效利用高分辨率熔解曲線、基因芯片等分子生物技術或者微量MIC、MODS等表型藥敏技術來進行快速藥敏鑒定[1-3]，吡嗪酰胺（PZA）目前已知并被常用來檢測的耐藥基因pncA.很難覆蓋所有的基因突變位點[4-6]，因其獨特的殺菌條件要求被國外推薦最有效的表型藥敏檢查方法BACTC MGIT960[7-8]，因儀器和試劑價格昂貴而很難在國內推廣應用。本課題組充分利用現有MTB表型藥敏檢測技術并結合一些特殊新材料，設計生產了一種可視化MTB藥敏檢測新型產品—底部包含有適量變色硅膠的微孔板和培養管（微孔板和培養管僅存在培養載體差別，技術特征及設計性能完全一致），已在前期利用微孔板測試了MTB臨床分離株的PZA藥物敏感性，確定液體培養基最佳pH值在5.7～5.9、最佳接種菌量為0.25 mg/ml、MIC最佳判斷界值為200 μg/ml、7～14 d即可報告結果并制定了相應的檢測流程[9]，本課題組就再次利用含有變色硅膠的培養管直接對臨床涂陽痰標本進行PZA藥物敏感性測試，結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 一般材料

1.1.1 菌株來源 牛分枝桿菌菌株和MTB標準菌株均采購自中國微生物菌種保藏中心，痰標本來自于2016年6月-2017年10月在南通市第六人民醫院結核科就診的158例涂陽肺結核患者。肺結核痰涂片抗酸桿菌陽性分級計數：以1+、2+、3+、4+記錄[10]。其中22例1+，23例2+，58例3+，55例4+。

1.1.2 試劑與儀器設備 PZA、對硝基苯甲酸（PNB）購自美國Sigma公司;Middlebrook7H9培養基干粉、61010A-1型比濁儀、BD培養液、Bactec MGIT960檢測儀購自美國BD公司;隔水式培養箱購自上海精宏實驗設備有限公司;變色硅膠培養管，由上海積彩醫療器械有限公司提供。

1.1.3 試劑配制 液體培養基（pH 5.8）配制參見文獻[11]，PZA先用去離子水溶解，再用配制的液體培養基進行稀釋，最終濃度設為200 μg/ml;PNB用配制的液體培養基稀釋，最終濃度為800 μg/ml。MIC最佳判斷界值為200 μg/ml。

1.2 方法

1.2.1 標本處理 先取合格痰標本1 ml置于試管內，再加入4%NaOH液4 ml，進行充分振蕩后移入37 ℃水浴箱內，15 min后取出試管用1 mmol/L的磷酸鹽緩沖液進行中和，離心后再次移入37 ℃水浴箱內。

1.2.2 培養管硅膠顯色法檢測涂陽標本PZA敏感性 參考文獻[9]設定測試管、陰性對照管、陽性對照管、PNB含藥管，測試管中加入0.4 ml終濃度為200μg/ml含PZA培養基，再接種標本處理液0.4 ml;陰性對照管加不含藥7H9液體培養基0.8 ml、不接種MTB菌液，作為陰性控制;陽性對照管加不含藥7H9液體培養基0.4 ml、接種MTB菌液0.4 ml。將培養管加蓋后置于37 ℃溫箱內進行培養，每天觀察培養管底硅膠顏色變化來判斷該測試孔內MTB是否對RFP耐藥。判斷方法參考文獻[12-13]，若對照管內底硅膠由天藍色變為黃色，PNB含藥管底硅膠尚未變色，則說明該標本中分枝桿菌為MTB;若對照管內底硅膠由天藍色變為黃色，PNB含藥管底硅膠由天藍色變為黃色，則說明標本中分枝桿菌為非結核分枝桿菌（NTM）。當陽性對照管底硅膠由天藍色變為黃色，測試管底硅膠尚未變色，說明測試管MTB生長被藥物抑制，判為敏感;而當測試管先于對照管或與對照管同時見管底硅膠顏色發生改變，說明藥物不能抑制測試管MTB繁殖，判斷該測試管內MTB對PZA耐受。

結果判斷：觀察為5～50 d，超過50 d不生長需重復試驗。質量控制：每次試驗均以牛分枝桿菌為耐藥株質控，H37Rv為敏感株質控。

1.2.3 BACTEC MGIT960檢測PZA藥物敏感性 按照文獻[14]及BACTEC MGIT960 操作說明，吸取標本處理液0.5 ml加入到 MGIT960液體培養管中，培養7～10 d后選取陽性培養管，吸取1 ml陽性培養液至4 ml無菌生理鹽水中作為稀釋菌液，再以此稀釋菌液按照1∶100進行稀釋作為對照，吸取500 μl稀釋菌液加有PZA的藥物培養管中顛倒混勻（培養基的藥物濃度為200 μg/mL），吸取500 μl稀釋菌液對照管中顛倒混勻，標記后分別置入BACTEC MGIT960培養箱，儀器會在若干天之內會自動報告檢測結果。質量控制：每次藥敏試驗均采用H37Rv標準株作為陽性參照。

1.3 統計學處理

使用SPSS 13.0統計軟件作為分析工具，計數資料以率（%）表示，采用字2檢驗，計量資料以（x±s）表示，采用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 培養管硅膠顯色法與Bactec MGIT960檢測158例涂陽痰標本PZA藥敏結果

培養管硅膠顯色法檢測結果：鑒定為NTM 2例，鑒定為MTB 153例，培養陰性3例;敏感MTB 126例，耐藥MTB 27例。Bactec MGIT960檢測結果：鑒定為NTM 2例，鑒定為MTB 153例，培養陰性3例;敏感MTB 129例，耐藥MTB 24例。以Bactec MGIT960檢測結果為標準：培養管硅膠顯色法與Bactec MGIT960檢測方法結果相符合148例，不符合5例，符合率為96.7%（148/153）;培養管硅膠顯色法敏感度為96.9%（125/129），特異度為95.8%（23/24），見表1。

2.2 培養管硅膠顯色法與Bactec MGIT960檢測痰標本PZA藥敏時間

從處理后的標本加入培養管開始計時，Bactec MGIT960藥敏報告時間為15～40 d，平均（23.3±2.0）d。培養管硅膠顯色法檢測時間16～44 d，平均（24.5±2.0）d。將兩者最終藥敏結果所需時間對比，培養管硅膠顯色法藥敏報告時間稍長于Bactec MGIT960藥敏報告時間，但差異無統計學意義（P>0.05），見表2。

3 討論

現階段耐藥結核病特別是耐多藥結核病的流行已成為嚴重困擾中國公共衛生的大問題[15-16]，而PZA是被用來控制耐藥結核病的重要藥物。因PZA藥物敏感性試驗要求非常高，因此國內很少有機構開展PZA藥敏試驗。為解決這一難題，本研究團隊設計制造出一種含變色硅膠的微孔板和培養管來嘗試檢測MTB對PZA藥物敏感性。設計原理及方法為：利用硅橡膠具有良好的二氧化碳吸附性能和固載酸堿指示劑離子能力[17-18]，將篩選的酸堿指示劑通過特殊工藝負載于硅膠固化，將適量的固載指示劑離子的變色硅膠通過特殊工藝附著在透明的微孔板或培養管底部。如果接種在微孔板患者培養管內液體培養基中的標本內有活的MTB存在，其生長代謝過程中會釋放二氧化碳（CO2）并通過透氣材料層和固載在硅膠內酸堿指示劑發生反應而出現硅膠顏色變化，間接監測、報告MTB生長代謝狀況，肉眼就能觀察結果。同時硅膠良好疏水性阻止水性溶液中的H+、OH-自由進出，故培養基液體pH值對固載在硅橡膠內酸堿指示劑無影響，完美地解決了一些可視化微量液體MTB藥敏檢測方法中將顏料或者指示劑直接加入培養基中、可能改變培養基的pH值而影響MTB生長最終導致藥敏結果判斷錯誤[19]。

本研究團隊已利用裝置了變色硅膠的微孔板和培養管在前期測試了MTB臨床分離株對異煙肼、利福平、乙胺丁醇、鏈霉素等抗結核藥物敏感性試驗，證明新產品可靠性能[13，20];也測試MTB臨床分離株的PZA藥物敏感性，并確定了最佳檢測條件和檢測時間。MTB臨床分離株是實驗室將含菌標本培養分離篩選出的優勢菌群、生長繁殖能力強，用于PZA藥物檢測容易定量且能較快得藥敏結果，但MTB臨床分離菌株獲取過程耗時較長難以滿足臨床需要。本試驗組根據前期利用微孔板變色硅膠顯色法對MTB臨床分離株PZA藥敏試驗獲得的數據，利用培養管變色硅膠顯色法直接對臨床涂陽痰標本中MTB進行PZA藥敏檢測，實驗結果提示：（1）最好選擇近期未接受抗結核藥物治療且分級計數3+以上痰標本，因為3+以上痰標本經過適當處理可達到或接近10-3 mg/ml檢測終濃度[21]，雖然達不到0.25 mg/ml最佳檢測要求，但基本可以用來進行直接測試。而分級計數在2+以上痰標本或已接受抗結核治療半月以上的痰標本，MTB活菌減少或者MTB活力減弱，藥敏結果報告時間會相對延長，如果用來直接進行PZA藥物敏感性檢測，最好采用集菌方法。（2）在MIC為200 μg/ml判斷界值下，利用培養管色硅膠顯色法所檢測獲得藥敏結果與Bactec MGIT960基本一致，較真實反映臨床痰標本中MTB的PZA藥物敏感性。（3）治療后痰標本中MTB菌群狀態較為復雜，因為活性下降或活菌數理較少，培養時間會相應延長，硅膠顏色改變緩慢且不明顯，肉眼判斷較困難，可借助辨光檢測儀來觀察對照管和檢測管硅膠顏色變化，對顏色的細微變化做出分辨，有條件可以考慮聯合基因檢測技術進行pncA耐藥基因檢測來提高檢出率[22]。（4）因為PZA這種僅能殺滅巨噬細胞內結核分枝桿菌MTB的抗結核藥物，需要pH 5.7～5.9的酸性環境下才能發揮其最強殺菌能力[23]，而同樣條件下結核分枝桿菌MTB繁殖非常緩慢，因此培養基的調配要求相應較高，本研究所用液體培養基成分與Bactec MGIT960培養基成分相似，保證了MTB在酸性培養基繁殖能力最優化。（5）利用變色硅膠培養管對158例臨床涂陽痰標本進行分枝桿菌菌型鑒定，結果鑒定與Bactec MGIT960完全一致，證明變色硅膠培養管在分枝桿菌培養及鑒定方面性能可靠。

本課題組利用變色硅膠培養管這一新型可視化MTB表型藥敏檢測工具直接檢測涂陽痰標本中MTB對PZA藥物敏感性，是為了提高檢測效率、根據結核病臨床快速藥敏試驗需要進行的研究，但在實際檢測過程中發現極少數痰標本中MTB藥敏檢測結果與Bactec MGIT960不一致，需要擴大樣本量進行系統研究分析差異原因，可能需要在變色硅膠的指示劑離子負載量、硅膠孔徑分布等方面進一步修正完善。變色硅膠培養管檢測技術原理科學、制作成本低，檢測結果易判讀且快速、精準，適合結核病實驗室推廣應用。

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（收稿日期：2019-09-12） （本文編輯：張亮亮）