骨髓間充質干細胞移植在急性肝衰竭中的應用效果及對IL-10水平的影響研究①

李文武 鮑傳裕 李元明

(海南省人民醫院急診內科，海口 570311)

急性肝衰竭(acute liver failure,ALF)是指肝臟合成、排泄、解毒與生物轉化功能發生不同程度障礙，部分患者可由失代償引起，導致肝臟產生嚴重的損傷[1]。ALF病因復雜，且發病后短期能引起劇烈的肝功能喪失，引起大量干細胞壞死，嚴重者將會引起肝昏迷[2]。我國ALF患者主要由病毒性肝炎引起，臨床多以傳統藥物治療為主，雖然能改善患者癥狀，但是治療預后較差[3]。近年來，隨著醫療技術的不斷發展，干細胞移植開始用于ALF患者中，其具有操作簡單、應用靈活、免疫源性弱，再加上治療費用低等特點，成為肝臟移植后急性肝衰竭有效的治療方法[4]。ALF的發生、發展是一個多因素過程，常涉及多種炎癥因子與細胞因子，其發病機制與肝細胞凋亡存在緊密聯系[5]。當機體感染后炎癥因子能介導肝細胞凋亡、壞死，再加上自身調節抗炎因子的釋放，能抑制免疫完成炎癥反應的調控[6，7]。IL-10來源于Th2和部分調節性T細胞，能抑制Th1細胞應答與合成細胞因子，能抑制巨噬細胞的抗原提呈功能與細胞因子的合成，能促進B細胞增殖、分化及抗體產生[8]。目前，臨床上對于骨髓間充質干細胞在ALF中的作用機制及對IL-10水平的影響研究較少[9]。因此，本文采用病例隨機對照方法開展研究，探討骨髓間充質干細胞移植在急性肝衰竭中的應用效果及對IL-10水平的影響，現報道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑與儀器 全自動生化分析儀(Beckman Coulter公司)；水合氯醛(吉林省康達動物藥液有限公司)；蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒(碧云天生物技術研究所)；中性樹脂(北京中山生物技術有限公司)；生物組織石蠟包埋機(湖北亞光醫用電子技術有限公司)；兔抗大鼠CD45、CD44、CD29、CD90(美國Abcam公司)；流式細胞儀(美國Beeton Dickinson公司)；外科手術器械(成都市科匯醫療器械有限責任公司)。

1.1.2實驗動物 選擇42只SD大鼠作為試驗對象，雌雄不限，體質量245～304 g，平均(281.68±8.74)g，動物合格證號：SCXK-2014-0016。所選動物均由動物實驗中心提供，SD大鼠常規飼養，自由攝食、飲水，光照12 h，建模前12 h禁食。2只2周齡SD大鼠完成骨髓間充質干細胞的分離制備；40只SD大鼠中隨機取10只設為假手術組；剩余30只大鼠制備大鼠急性肝衰竭動物模型。建模成功后隨機將大鼠分為模型對照組(n=15)和治療組(n=15)。

1.2方法

1.2.1骨髓間充質干細胞的分離制備及鑒定 ①細胞的分離與培養：選擇2只2周齡的SD大鼠，以斷頸方式處死，并放置在75.0%乙醇中連續進行20 min 浸泡，采用紫外燈完成超凈臺的消毒。上述操作完畢后在超凈臺上取大鼠股骨、脛骨，去除附著的皮肉后采用PBS進行浸泡、沖洗。取剝離干凈的股骨頭，將其兩端切開，采用5 ml注射器抽取無血清DMEM培養基，將骨髓細胞沖出，用離心管收集，50 μm網篩過濾。離心后去除上層清液，加入DMEM中連續10次吹打，使得細胞分布均勻，再次離心后進行多次洗滌，吹打均勻后加入小培養瓶，加入含10.0%FBS的低糖DMEM培養基中進行培養。37℃下常規放入培養箱中，24 h后首次換液，此后每3 d換液一次，觀察細胞形態、數量，待細胞融合80.0%后進行傳代培養，取第三代骨髓間充質干細胞備用[10]。②細胞鑒定：常規條件培養下加入低糖DMEM培養基、10.0%胎牛血清進行培養，待細胞融合80.0%以上后加入胰酶進行消化，制成單細胞懸液，采用PBS吹打離心，清洗2次后獲得骨髓間充質干細胞，電子顯微鏡下觀察細胞并完成細胞計數，每份細胞樣本保證達到106級；向細胞中加入MSCs表面標記的兔抗大鼠CD45、CD44、CD29、CD90，采用流式細胞儀進行分析[11]。

1.2.2急性肝衰竭動物模型建立及處理 ①急性動物模型建立：取參與建模的SD大鼠30只，建模前12 h禁食，6 h禁水。采用濃度為10.0%水合氯醛進行麻醉，劑量0.3 ml/100 g，在麻醉狀態下取10.0%D-氨基半乳糖1.4 g/(kg·次)與0.005%脂多糖20 μg/kg經腹腔注射，制備大鼠急性肝衰竭動物模型[12,13]。建模成功后隨機將大鼠分為模型對照組(n=15)和治療組(n=15)。②處理方法：假手術組與模型對照組腹腔注射等體積生理鹽水，治療組經尾靜脈注射第三代骨髓間充質干細胞1.4×107細胞/kg。

1.2.3觀察指標 ①骨髓間充質干細胞形態與鑒定：觀察分離制備的骨髓間充質干細胞形態與干細胞表面標志物CD45、CD44、CD29、CD90表達情況。②肝功能水平：分別在移植前、移植后48 h收集血液樣本，1 726 g離心35 min，血清分離后采用全自動生化分析儀完成大鼠血清谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、總膽紅素(TBIL)及白蛋白(ALB)水平[14,15]。③炎癥因子水平：取上述分離的血清標本，采用酶聯免疫吸附試驗完成大鼠TNF-α、IL-6、IL-10水平[16,17]。④肝臟組織切片HE染色：各組大鼠干預后48 h每組取大鼠5只，以斷頸法處死，立即開腹切除肝臟組織，剪成體積為0.5 cm3小塊，去除多余的血跡、組織，放置在中性福爾馬林溶液中，固定。石蠟包埋后制備4 μm切片，完成HE染色，在光鏡下觀察組織的病理學變化[18]。

2 結果

2.1參與者數量分析 本研究中納入SD大鼠42只，SD大鼠42只中2只用于骨髓間充質干細胞的分離、制備，剩余40只大鼠中30只參與建模，建模后恢復良好，所有大鼠數據全部進入結果分析，中途無脫落，未見死亡。

2.2骨髓間充質干細胞形態與鑒定 電子顯微鏡結果顯示：分離制備的細胞多呈梭形生長，有粗大的突起，且細胞培養后5 d可見細胞成纖維樣生長并向瓶底克隆；傳代后細胞呈長梭形、紡錘形，未見細胞分化，見圖1。

流式細胞儀結果表明：分離制備的細胞中CD29+占99.5%、CD44+占96.4%、CD90+占96.70%，而CD45+僅為0.60%，說明獲得的細胞純度較高，符合骨髓間充質干細胞特性，見圖2。

2.3各組大鼠肝功能水平比較 治療組與模型對照組干預前各肝功能水平均無統計學意義(P>0.05)；治療組移植后ALT、AST、TBIL水平均低于模型對照組(P<0.05)；治療組移植后ALB水平高于模型對照組(P<0.05)，治療組與模型對照組ALT、AST、TBIL水平均高于假手術組(P<0.05)；治療組與模型對照組ALB水平均低于假手術組(P<0.05)，見表1。

圖2 骨髓間充質干細胞流式細胞術鑒定Fig.2 Identification results of bone marrow mesenchymal stem cells by flow cytometry

GroupsALT(U/L)AST(U/L)TBIL(μmol/L)ALB(g/L)Therapy groupBefore transplantation346.32±25.981)241.68±21.771)17.67±2.141)16.32±2.121)After transplantation 35.39±3.231)2)3) 70.32±5.731)2)3)1.71±0.961)2)3)36.49±3.581)2)3)Model control groupBefore transplantation349.63±27.641)240.53±21.561)17.32±2.151)16.33±2.141)After transplantation 435.29±34.631)3) 332.14±24.391)3)19.66±2.181)3)13.29±2.111)3)Prosthetic surgery group23.52±2.0934.31±3.69 1.21±0.8445.79±4.52

Note：Compared with the prosthetic surgery group,1)P<0.05;compared with the model control group,2)P<0.05;compared with before transplantation,3)P<0.05.

GroupsTNF-α(pg/ml)IL-6(pg/ml)IL-10(pg/ml)Therapy groupBefore transplantation34.48±4.651)167.32±11.311)95.88±5.731)After transplantation7.82±3.241)2)3) 56.98±4.641)2)3)28.68±3.241)2)3)Model control groupBefore transplantation34.50±4.671)167.33±11.321)95.94±5.751)After transplantation44.69±5.631)3)178.95±13.291)3)46.78±4.981)3)Prosthetic surgery group5.21±4.3150.39±3.51 11.39±1.41

Note：Compared with the prosthetic surgery group,1)P<0.05;compared with the model control group,2)P<0.05;compared with before transplantation,3)P<0.05.

圖3 各組SD大鼠的HE染色(×100)Fig.3 HE staining of each group of SD rats(×100)Note: A.The model control group;B.The treatment group;C.The prosthetic surgery group.

2.4各組炎癥因子比較 治療組與模型對照組移植前各炎癥因子比較均無統計學意義(P>0.05)；治療組移植后炎癥因子TNF-α、IL-6及IL-10水平均低于模型對照組(P<0.05)；治療組與模型對照組移植前、后炎癥因子TNF-α、IL-6及IL-10水平均高于假手術組(P<0.05)，見表2。

2.5各組大鼠肝組織HE染色 假手術組未參與建模，HE染色下肝細胞分布均勻、飽滿，未見炎癥反應；假手術組HE染色下肝小葉結構嚴重破壞，肝細胞膨脹、腫大，可見大量炎癥細胞浸潤；治療組HE染色下肝細胞受到破壞，存在部分炎癥細胞聚集，肝細胞略微腫大，見圖3。

3 討論

肝衰竭是臨床上常見的重癥肝病，其病因相對較多，主要是由于肝細胞、肝臟內相關細胞過度死亡引起[19]。臨床研究表明：肝臟大面積壞死與肝細胞凋亡、微循環障礙等有關，導致細胞過度凋亡[20]。肝臟移植術是急性肝衰竭的首選治療方法，能有效改善患者癥狀，降低臨床死亡率，但是該手術治療時肝臟供體數量較少，且移植后存在明顯的免疫排斥反應。近年來，隨著醫療技術的不斷發展，骨髓間充質干細胞移植開始用于急性肝衰竭研究中[21]。骨髓間充質干細胞是一種源于中胚層的全能干細胞，具有自我更新能力強，定向分化作用，能在特定條件下向骨、軟骨、成神經細胞等方向發展，且細胞亦具有較強的免疫調節作用。臨床研究表明：骨髓間充質干細胞來源相對較廣，如：臍帶、脂肪、胎盤、外周血等，取材相對容易、便于自體移植[22]。因此，本研究以SD大鼠作為對象，采用密度梯度離心法+貼壁篩選分離法完成骨髓間充質干細胞的分離與培養及鑒定，電子顯微鏡結果顯示：分離制備的細胞多呈梭形生長，有粗大的突起，且細胞培養后5 d可見細胞成纖維樣生長并向瓶底克隆；傳代后細胞呈長梭形、紡錘形，未見細胞分化；流式細胞儀結果表明：分離制備的細胞中CD29+占99.5%、CD44+占96.4%、CD90+占96.70%，而CD45+僅為0.60%，說明獲得的細胞純度較高，符合骨髓間充質干細胞特性，從而能為本研究順利進行奠定基礎。

本研究中，以SD大鼠作為對象，完成大鼠ALF動物模型建立，并給予大鼠骨髓間充質干細胞移植，結果表明：治療組移植后ALT、AST、TBIL水平均低于模型對照組(P<0.05)；治療組移植后ALB水平高于模型對照組(P<0.05)，治療組與模型對照組ALT、AST、TBIL水平均高于假手術組(P<0.05)，說明骨髓間充質干細胞移植能改善急性肝衰竭大鼠肝功能水平，利于大鼠恢復。主要是由于骨髓間充質干細胞來源的細胞因子能防止肝細胞壞死，提高急性肝衰竭生存率[23]。骨髓間充質干細胞具有抑制肝細胞凋亡、促進肝細胞增殖的作用，能通過旁分泌作用，分泌多種細胞生長因子，從而能促進肝細胞再生，抑制炎癥反應及細胞凋亡[24]。國內學者研究表明：在急性肝衰竭早期阻斷其細胞凋亡、促進肝再生有助于提高患者生存率[25]。本研究中，假手術組未參與建模，HE染色下肝細胞分布均勻、飽滿，未見炎癥反應；假手術組HE染色下肝小葉結構嚴重破壞，肝細胞膨脹、腫大，可見大量炎癥細胞浸潤；治療組HE染色下肝細胞受到破壞，存在部分炎癥細胞聚集，肝細胞略微腫大，說明骨髓間充質干細胞移植能減輕肝細胞破壞、受損，降低炎癥反應。肝衰竭的發生、發展是一個多因素過程，常伴有炎癥因子的共同參與[26]。TNF-α是一種能直接殺死腫瘤細胞而對正常細胞無明顯毒性的細胞因子，由激活的巨噬細胞產生，能抑制成骨細胞活性,提高破骨細胞因子表達水平[27]。IL-6是由活化T細胞、成纖維細胞產生的淋巴因子，能使得B細胞前體產生抗體，有助于集落刺激因子，促進原始骨髓細胞的生長、分化，從而提高自然殺傷細胞的裂解作用[28，29]。IL-10幾乎存在于所有的淋巴細胞中，但主要源于單核巨噬細胞、T輔助細胞，釋放大量免疫介質，抑制單核細胞釋放炎癥介質。TNF-α、IL-6及IL-10在正常人體中表達水平相對較低或不表達，但是對于急性肝衰竭者，持續的應激反應容易增加TNF-α、IL-6及IL-10水平，并產生瀑布聯級反應，加劇疾病發展[30]。本研究中，治療組移植后炎癥因子TNF-α、IL-6及IL-10水平均低于模型對照組(P<0.05)，說明骨髓間充質干細胞移植能降低肝衰竭炎癥因子水平，從根本上控制疾病發展。綜上所述，骨髓間充質干細胞移植用于肝衰竭中能提高肝功能水平，能降低IL-10水平，減輕肝臟局部炎癥細胞聚集，從而緩解肝臟組織病理損傷，能為急性肝衰竭治療提供理論依據。