蝦青素對ApoE基因敲除小鼠動脈粥樣硬化的降脂、抗氧化和抗炎作用研究

張克連 郭靜宜 戴若竹

(福建省泉州市第一醫(yī)院心血管內(nèi)科，泉州 362000)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是多種心腦血管疾病共同的病理學基礎。由AS導致的心肌梗死、腦中風等疾病已成為嚴重危害人類健康的主要疾病之一，給社會和家庭帶來沉重負擔，近些年AS的發(fā)病率越來越高，且呈年輕化趨勢，因此控制AS的發(fā)生發(fā)展對預防和治療心腦血管系統(tǒng)疾病尤為重要。大量研究表明，膽固醇可能參與了AS的發(fā)生和發(fā)展，低密度脂蛋白及其氧化型能增加動脈壁膽固醇內(nèi)流和沉積，促進AS形成；相反，高密度脂蛋白和氧化型高密度脂蛋白則通過抑制固醇內(nèi)流和沉積，從而阻止AS的發(fā)生發(fā)展[1]。研究也表明，炎癥是AS的重要特征和啟動因子，它導致血管中的中性粒細胞和單核細胞浸潤，從而促進脂質(zhì)沉積。在AS的發(fā)展中，IL-6、單核細胞趨化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)等炎癥因子發(fā)揮著重要作用[2,3]。

低密度脂蛋白的氧化假說給AS的抗氧化治療提供了理論依據(jù)。許多抗氧化性物質(zhì)用于阻滯動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展研究[4,5]。蝦青素(astaxanthin)是一種類胡蘿卜素，是最強的天然抗氧化劑之一，能有效清除細胞內(nèi)的氧自由基，增強細胞再生能力，除此之外還能增強免疫力，預防心腦血管疾病[6]。本研究應用ApoE基因敲除(ApoE-/-)小鼠建立AS模型，采用蝦青素進行干預，研究蝦青素在降低脂質(zhì)，對抗氧化、炎癥因子和血小板聚集等方面對AS產(chǎn)生的保護效應。

1 材料與方法

1.1材料 蝦青素(≥95%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；總膽固醇(total cholesterol,TC)、三酰甘油(triglyceride,TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)試劑盒(上海信裕生物科技有限公司)；總抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)、總超氧化物歧化酶(total superoxide disumutase,T-SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；小鼠IL-6、小鼠MCP-1和小鼠超敏C反應蛋白(C-reactive protein,CRP)(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司)。

雄性ApoE-/-小鼠，體質(zhì)量(20±2)g(北京大學動物實驗中心,SPF級，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXR(京)2014-0004，合格證號:11401300034676)。

Synergy2 多功能酶標儀(美國伯騰公司)，高速離心機(美國Sigma公司)，全自動生化檢查儀，血糖監(jiān)測儀，光學顯微鏡(日本Olympus公司)，凝聚計(美國Chrono-log公司)。

1.2方法

1.2.1小鼠的飼養(yǎng) 取小鼠40只單獨喂養(yǎng)，隨機分為4組：正常組(10只)、高脂組(10只)，蝦青素低劑量組(10只)和蝦青素高劑量組(10只)。正常組自由攝入普通飼料和水，高脂組和蝦青素治療組均給予高脂飲食(含有75%普通飼料，10%豬油、0.3%膽酸和15%蛋黃粉)喂養(yǎng)。將蝦青素與0.5%蔗糖酯水溶液混合制成混懸液，每天經(jīng)口灌胃給藥0.2 ml，低和高劑量分別為50 mg/kg和150 mg/kg，模型組和正常組每天給予0.2 ml 0.25%蔗糖酯水溶液。于實驗開始時，定期對小鼠進行稱重。每2日更換墊料，添加1次食物，喂養(yǎng)時間150 d。

1.2.2血脂和血糖指標的測定 于喂養(yǎng)后50 d、100 d 和150 d，禁食12 h，穿刺眼球后靜脈叢取血0.4～0.5 ml，3 000 g離心10 min，取血清，采用全自動生化檢查儀檢測TC、TG、LDL-C和HDL-C水平，采用血糖監(jiān)測儀測定血糖水平。

1.2.3氧化指標的測定 取1.2.2項下喂養(yǎng)150 d的各組小鼠的血清，分別采用黃嘌呤氧化酶法(羥胺法)、ABTS法、比色法和硫代巴比妥酸法檢測T-SOD、T-AOC、GSH-Px和MDA水平。

1.2.4炎癥因子的測定 取1.2.2項下喂養(yǎng)150 d的各組小鼠的血清，按照ELISA試劑盒的說明書操作，測定血漿中炎癥因子IL-6、CRP和MCP-1的水平。

1.2.5血小板聚集 取1.2.2項下喂養(yǎng)150 d的各組小鼠的全血0.5 ml，置于3.2%檸檬酸鹽緩沖液中，按照文獻[7]于37℃下(采用2-通道凝集計)進行光學血小板聚集試驗，5 min左右會出現(xiàn)最大聚集，作為聚集度的測定值。

1.2.6主動脈取材及斑塊分析 取喂養(yǎng)150 d的各組小鼠，2%戊巴比妥麻醉小鼠，快速取出自心臟始發(fā)1～2 mm處主動脈。主動脈用生理鹽水灌流，放置于多聚甲醛中固定，過夜后轉(zhuǎn)入20%蔗糖溶液脫水。取脫水后的主動脈，縱向剖開，量取油紅O液染色1 h，用60%異丙醇浸泡標本至斑塊底色為白色。蒸餾水清洗后將主動脈于黑色硅膠墊上平鋪固定，鏡檢拍照，用Image J軟件記錄并分析測量斑塊面積，以斑塊面積占主動脈內(nèi)膜總面積的百分比數(shù)作為斑塊大小的評價指標。

用OCT包埋整個主動脈根本，并用液氮快速冷凍，進行冷凍切片，切片厚度為7 μm，對每一根胸主動脈至少進行5個橫剖面的分析。用于油紅O染色的切片恢復室溫后使用蒸餾水潤洗,后置于100%丙二醇溶液脫水2 min，用油紅O工作液室溫下染色1 h，鏡檢拍照。

2 結果

2.1蝦青素對小鼠體重的影響 各組小鼠飲食正常，毛被正常，體重穩(wěn)定增加，未出現(xiàn)死亡情況和疾病異常。高脂組小鼠體重增幅最大，與正常組小鼠體重相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，蝦青素低劑量組和高劑量組體重增幅略低于高脂組，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，提示蝦青素對小鼠無毒副作用，對小鼠體重的增長無顯著影響，見圖1。

2.2生化指標分析

2.2.1蝦青素對血脂和血糖的影響 與正常組比，高脂組血清中TC、TG、LDL-C和血糖水平都顯著升高(P<0.05)，HDL-C顯著降低(P<0.05)。與高脂組比較，蝦青素組血清中TC、TG、LDL-C和血糖水平均顯著降低(P<0.05)，HDL-C顯著增高(P<0.05)，且呈劑量依賴性趨勢，見圖2。

2.2.2蝦青素對血清中的T-SOD、T-AOC、MDA和GSH-Px水平的影響 與正常組比，高脂組的T-SOD、T-AOC和GSH-Px明顯降低(P<0.01)，MDA明顯增高(P<0.01)，與高脂組比，蝦青素組的T-SOD、T-AOC和GSH-Px均有不同程度地升高(P<0.05)，MDA不同程度地降低(P<0.05)，呈劑量依賴性趨勢，見表1。

2.2.3蝦青素對血清中的炎癥因子MCP-1、CRP和IL-6的影響 與正常組比，高脂組MCP-1、CRP和IL-6水平均顯著增高(P<0.01)，與高脂組比，蝦青素組的MCP-1、CRP和IL-6水平均明顯降低(P<0.01)，呈劑量依賴性趨勢，見圖3。

2.3蝦青素對動脈硬化斑塊的影響 正常組血管管壁較光滑，內(nèi)膜無明顯增厚，未見明顯斑塊形成，斑塊面積占主動脈內(nèi)膜總面積的百分比為(13.14±0.61)%。高脂組小鼠主動脈血管壁染色層明顯增厚，而且厚薄不均勻無規(guī)則，內(nèi)皮有部分脫落現(xiàn)象，這說明脂質(zhì)累積成為脂質(zhì)池，有大量的泡沫細胞和炎癥細胞浸潤血管，使管內(nèi)形成明顯的斑塊，斑塊面積占主動脈內(nèi)膜總面積的百分比為(41.23±6.57)%，與正常組比明顯增高(P<0.01)。與高脂組比，蝦青素高(30.14±5.47)%和低劑量(28.71±4.2)%組斑塊面積占主動脈內(nèi)膜總面積的百分比數(shù)明顯降低(P<0.05)，見圖4。

2.4蝦青素對血小板聚集的抑制作用 高脂組、蝦青素高劑量組及蝦青素低劑量組的血小板聚集度分別為(40.6±1.6)%、(29.4±3.1)%和(15.4±4.2)%，與高脂組相比，蝦青素組血小板聚集度明顯降低(P<0.05)，且呈劑量依賴性趨勢。

圖1 蝦青素對小鼠體重增長的影響Fig.1 Effect of astaxanthin on body weight of mice

圖2 不同時間各組ApoE-/-小鼠的TC、TG、LDL-C、HDL-C和血糖水平Fig.2 Comparison of TC,TG,LDL-C,HDL-C and blood glucose of different groups of AopE-/- mice in different timeNote: Compared with the normal group,#.P<0.01;compared with the high fat group,△.P<0.05,*.P<0.01.

表1 各組ApoE-/-小鼠血清中的T-SOD、T-AOC、MDA和GSH-Px的水平

Tab.1 Comparison of T-SOD，T-AOC，MDA and GSH-Px level of different groups of ApoE-/-mice

GroupsT-SOD(U/ml)T-AOC(U/ml)MDA(nmol/ml)GSH-Px(U/ml)Normal135.26±3.653.18±0.6231.93±2.98210.25±4.13High fat90.31±9.611)1.42±0.871)56.54±5.251)155.38±2.491)Astaxanthin low dose132.35±5.573)2.29±0.972)30.12±4.573)248.27±4.513)Astaxanthin high dose144.12±3.693)3.61±0.293)28.09±6.123)310.21±5.793)

Note：Compared with the normal group,1)P<0.01；compared with the high fat group,2)P<0.05,3)P<0.01.

圖3 各組ApoE-/-小鼠的炎癥因子Fig.3 Comparison of inflammatory factors of different groupsNote: Compared with the normal group,#.P<0.01；compared with the high fat group,*.P<0.01.

圖4 不同組ApoE-/-鼠胸主動脈病理圖Fig.4 Histomorhologic changes in aorta of different groups

3 討論

研究表明，動物高脂喂養(yǎng)后，其血清中TC、TG和LDL-C等水平明顯升高，HDL-C水平降低。經(jīng)過長時間高脂喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠在動脈上能形成AS脂質(zhì)斑塊，為此建立了實驗用的AS模型。人類長期食用高脂高糖膳食也會造成血脂異常和血管硬化[8]。本研究用蝦青素干預高脂喂養(yǎng)的小鼠，扭轉(zhuǎn)了TC、TG、LDL-C及血糖水平緩慢升高的趨勢，而且使其各指標降低。高劑量組指標降低更顯著，說明具有劑量依賴性。HDL-C將血管床中多余的膽固醇轉(zhuǎn)運至肝臟后由膽汁排出體外。HDL-C的升高會有助于TC的降低。

LDL-C氧化修飾被認為是AS形成的關鍵啟動因素。氧化低密度脂蛋白(oxLDL-C)具有細胞毒性，能引起血管內(nèi)皮細胞功能和結構的改變，例如內(nèi)皮細胞變性、壞死或者脫落，破壞內(nèi)皮細胞完整性。血液中的單核細胞及LDL通過損傷的血管內(nèi)皮進入內(nèi)膜下，加速脂質(zhì)條紋的形成。oxLDL也是刺激內(nèi)皮細胞和單核細胞/巨噬細胞分泌多種炎癥的因子。oxLDL能夠上調(diào)巨噬細胞表明的清道夫受體數(shù)量并被過度攝取，導致胞內(nèi)大量膽固醇聚集進而形成泡沫細胞，大量泡沫細胞停留在血管壁內(nèi)，使AS斑塊形成[9]。通過觀察小鼠AS斑塊發(fā)現(xiàn)，確實存在碎片脫落和脂質(zhì)堆積結構中間空隙較大現(xiàn)象，這可能與oxLDL能夠改變血管內(nèi)皮細胞結構有關。

蝦青素是一種具有強大抗氧化特性的類胡蘿卜素，其抗氧化活性是維生素E的550倍,是β-胡蘿卜素、玉米黃素、葉黃素和角黃素等類胡蘿卜素的10倍，被譽為“超級抗氧化劑”。在提高免疫力、抗癌抗腫瘤、保護眼睛和中樞神經(jīng)系統(tǒng)、延緩衰老等方面具有積極的促進作用。機體的氧化應激是指由于自由基過量生成和/或細胞內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)受損，導致氧自由基及其相關代謝產(chǎn)物過量聚集，從而對細胞產(chǎn)生多重毒性作用的病理狀態(tài)。人體很多疾病(比如心臟病、糖尿病、關節(jié)炎、癌癥和心腦血管疾病等)的發(fā)生和發(fā)展與自由基參與的氧化作用有關[10]。T-AOC是反映機體整體抗氧化水平的重要指標。SOD為酶型抗氧化物質(zhì)，能清除超氧陰離子。MAD是脂質(zhì)過氧化反應的代謝產(chǎn)物，MDA的測定常常與SOD的測定相互配合，SOD活力的高低間接反映了機體清除氧自由基的能力，而MDA的高低又間接反映了機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度，是反映氧化應激較好的指標[9]。當機體細胞受到氧化自由基攻擊后，會引發(fā)脂質(zhì)的過氧化作用，從而促使MDA的產(chǎn)生。所以血清中MDA的含量可以反映機體的氧化情況[10]。研究檢測血清中T-AOC、SOD、MDA和GSH-Px水平，高脂組小鼠的T-AOC、SOD和GSH-Px水平下降明顯，而MDA水平明顯提高。表明高脂飲食誘導了脂質(zhì)過氧化物，從而使機體的抗氧化防御機制受損，而蝦青素的干預能明顯改善實驗小鼠的抗氧化能力。

炎癥因子研究結果表明，蝦青素干預高脂喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠，能顯著降低血清中的炎癥因子IL-6、MCP-1和CRP水平，而且高劑量組降低更明顯，說明蝦青素對AS的ApoE-/-小鼠具有抗炎作用且有劑量依賴性。AS具有慢性炎癥反應特征的病理過程，而且AS從粥樣硬化斑塊形成到斑塊破裂，以及血栓形成的各個階段都少不得炎癥細胞和炎癥介質(zhì)的參與。IL-6由纖維細胞、單核細胞和T細胞等分泌，可通過誘導血小板源生長因子促進血管平滑肌增殖，從而促進AS的進程。IL-6為調(diào)節(jié)體內(nèi)免疫功能和代謝過程的細胞因子，在動脈粥樣硬化斑塊的肩區(qū)表達,通過刺激 MMP、MCP-1和TNF-α表達導致斑塊不穩(wěn)定。在AS斑塊的CRP是反映感染和療效的指標，水平高表明機體炎癥水平高。有研究表明，絕大部分心肌梗死患者CRP水平都很高。臨床已經(jīng)將CRP水平用于預測心腦血管疾病的發(fā)生風險[2]。單核細胞黏附于血管壁并進入內(nèi)皮細胞形成泡沫細胞是AS早期病變。大量研究表明單核細胞趨化主要由MCP-1實現(xiàn)，臨床冠狀AS的MCP-1水平也增高[3]。

血小板不僅能促進血栓形成，而且還是炎癥和動脈粥樣硬化的重要關聯(lián)體。血小板可能激活炎癥反應、釋放細胞因子，介導內(nèi)皮黏附以及相關脂蛋白的調(diào)節(jié)作用。研究表明高脂血癥患者的β-血小板球蛋白及血小板因子含量增加，血小板聚集性增強，表明高脂血癥患者的血小板活化加強[11]。體外實驗證明，高脂血癥患者血小板比正常人血小板對促聚集劑更敏感。LDL-C能增加ADP誘導的纖維蛋白原與血小板的結合，其增強作用與LDL之間呈劑量依賴關系，通過這種增強作用，LDL能加快血小板的聚集，而oxLDL增加血小板聚集的作用更強[12]。研究發(fā)現(xiàn)，蝦青素干預組血小板聚集明顯降低，這可能與蝦青素降低LDL和oxLDL有關系。