miRNA-200a靶向BRD4對非小細胞肺癌上皮間質轉化的影響

田曉靜 周伊蘭 薛宏峰

(南京中醫藥大學附屬常州市中醫醫院檢驗科，常州 213003)

肺癌是全世界發病率和死亡率最高的惡性腫瘤，其中非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)約占總肺癌病例數的85%以上，且易轉移、預后差，總體生存率低于20%[1,2]。因此深入研究NSCLC發病及轉移復發的分子機理對其臨床診療具有重要價值。MicroRNAs (miRNAs)是一種長度為21～23個核苷酸的內源性的保守非編碼小RNA，既往研究顯示miRNAs通過與靶mRNA 3′-UTR區的不完美配對，在轉錄后水平上負向調控基因的表達，從而廣泛參與包括腫瘤發生發展在內的多種生理和病理過程[3]。miRNA-200a是miRNA-200家族成員之一，研究顯示miRNA-200a在乳腺癌、肝癌、腎癌以及子宮內膜癌等多種腫瘤的上皮間質轉化(epithelial-mesenehymal transition，EMT)、侵襲、轉移中起著重要作用[4,5]。本研究旨在探討miRNA-200a對NSCLC細胞EMT的影響及其可能的作用途徑。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1一般資料 收集2017年1月至2018年12月于我院進行手術的NSCLC患者肺癌組織65例，同時取其癌旁組織(病理學檢查確認無腫瘤細胞浸潤)作為對照。納入標準：①所有患者經病理學檢查確認為NSCLC；②患者臨床病理資料完整；③患者術前均未接受放療、化療以及其他抗腫瘤治療；④排除合并重大臟器功能疾病、自身免疫性疾病以及嚴重內分泌疾病患者。其中男性48例，女性17例；年齡43～69歲，平均年齡(57.8±5.7)歲；根據WHO肺癌分類標準：鱗癌41例，腺癌24例； TNM分期：Ⅰ期16例，Ⅱ期27例，Ⅲ 期22例；淋巴結轉移35例，淋巴結未轉移30例。本研究經我院倫理委員會批準，患者或其家屬均簽署知情協議書。

1.1.2試劑和儀器 人非小細胞肺癌細胞系A549購自上海中國科學院生物化學與細胞生物學研究所。RNAprep pure動物組織總RNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis逆轉錄試劑盒、Applied Biosystems TaqMan RT-PCR試劑盒、LipofectamineTM2000轉染試劑、ECL化學發光液均購自美國Thermo Fisher Scientific公司。pAD-MIR-GFP-miRNA-200a或pAD-MIR-GFP-NC腺病毒表達載體購自山東維真生物科技公司。Dual-Luciferase?Reporter Assay System檢測試劑盒購自美國Promega公司。BRD4、E-cadherin、Vimentin鼠單克隆抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology公司。Transwell小室購自美國Corning公司。

1.2方法

1.2.1RT-PCR 采用動物組織總RNA提取試劑盒分離NSCLC組織和癌旁組織總RNA，采用逆轉錄試劑盒將總RNA反轉錄為cDNA。從NCBI上查詢人源miRNA-200a和內參GAPDH的核苷酸序列，并設計、合成RT-PCR反應引物： miRNA-200a-F：5′-CCCCTGTGAGCATCTTACC-3′，miRNA-200a-R：5′-GCGGGTCACCTTTGAACATC-3′；GAPDH-F：5′-CCACAGTCCATGCCATCAC-3′，GAPDH-R：5′-CAGGTCAGGTCCACCACTG-3′。根據RT-PCR試劑盒說明書配置反應體系，上機，設置RT-PCR反應程序：95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，40個循環。反應結束后采用2-ΔΔCt法分析miRNA-200a 的mRNA相對表達水平。

1.2.2穩定細胞系構建 pAD-MIR-GFP-miRNA-200a或pAD-MIR-GFP-miRNA-NC腺病毒表達載體分別用LipofectamineTM2000轉染試劑轉染人HEK 293T細胞，6 h后換液。48 h后熒光顯微鏡下觀察細胞有綠色熒光出現表明轉染成功。收集病毒培養上清，0.45 μm無菌濾器過濾，將病毒分別感染指數生長期的人非小細胞肺癌細胞系A549細胞，37℃、5%CO2繼續培養48 h，培養基中加入1 μg/ml的嘌呤霉素篩選未成功感染的細胞，至顯微鏡下的細胞均發出綠色熒光時表明miRNA-200a和miRNA-NC腺病毒過表達細胞系構建成功。

1.2.3熒光素酶報告基因檢測 生物信息學分析BRD4可能是miRNA-200a的一個潛在的靶基因。克隆野生型BRD4的3′-UTR區(BRD4-WT)和缺失miRNA-200a配對區域的突變體BRD4的3′-UTR區(BRD4-MUT)片段，并構建到熒光素酶報告基因載體pMIR-Report上。指數期miRNA-200a和miRNA-NC腺病毒過表達細胞消化、計數，等密度接種到12孔板中，當細胞密度達到70%時，分別轉染BRD4-WT和BRD4-MUT熒光素酶報告基因載體和對照熒光質粒pRL-TK，培養48 h，采用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測細胞熒光素酶相對活性。

1.2.4Western blot 指數期miRNA-200a和miRNA-NC腺病毒過表達細胞消化、計數，等密度接種到6孔板中，miRNA-NC細胞接種1組，miRNA-200a細胞接種3組。構建pcDNA3.1-BRD4真核過表達載體，pcDNA3.1空載和pcDNA 3.1-BRD4過表達載體分別轉染其中2組miRNA-200a細胞，其他組細胞加入等體積的轉染試劑。24 h后收集細胞，RIPA裂解液冰上裂解30 min，高速離心取上清，加入5×SDS Loading buffer，煮沸10 min，SDS-PAGE電泳，轉膜，封閉。分別加入BRD4(1∶300)、E-cadherin(1∶200)、Vimentin(1∶500)抗體，4℃孵育過夜。PBST洗3次，加入二抗(1∶5 000)室溫孵育2 h，PBST洗 3次，涂抹ECL化學發光液，Bio-Rad凝膠儀分析miRNA-NC組、miRNA-200a組、miRNA-200a+pcDNA組和miRNA-200a+ BRD4組中各蛋白的表達水平。

1.2.5Transwell分析 miRNA-NC組、miRNA-200a組、miRNA-200a+pcDNA組和miRNA-200a+BRD4組細胞胰酶消化，PBS洗2次，用5% FBS的培養基重懸并調整密度至5×105個/ml，分別接種100 μl細胞懸液到Transwell小室中，下室添加500 μl完全培養基。24 h后PBS洗滌Transwell小室2次，甲醇固定30 min。PBS洗滌2次，0.1%結晶紫孵育20 min。PBS洗滌2次，并用棉簽擦除上層未遷移細胞，顯微鏡下觀察細胞侵襲情況。

2 結果

2.1miRNA-200a在NSCLC組織和癌旁組織中的表達 RT-PCR結果顯示，癌旁組織和NSCLC組織中miRNA-200a的mRNA相對表達水平分別為1.66±0.12和0.46±0.07，miRNA-200a在NSCLC組織中的相對含量顯著低于其癌旁組織，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1。

2.2miRNA-200a與BRD4靶向關系的驗證 采用生物信息學在線預測網站(http://www.targetscan.org/)分析miRNA-200a可能的作用靶點，結果顯示：BRD4 mRNA 3′UTR與miRNA-200a存在互補區域，可能是它的一個潛在作用靶基因，見圖2A。雙熒光素酶報告基因檢測結果表明，在過表達BRD4-WT的細胞中，miRNA-200a組細胞的相對熒光素酶活性顯著低于miRNA-NC組細胞(P<0.05)；而在過表達BRD4-MUT的細胞中，miRNA-200a組和miRNA-NC組細胞的相對熒光素酶活性差異無顯著統計學意義(P>0.05)，見圖2B。

2.3miRNA-200a過表達對BRD4、E-cadherin、Vimentin蛋白表達的影響 采用Western blot探究miRNA-200a靶向BRD4是否影響NSCLC細胞EMT標志蛋白的表達。結果顯示與miRNA-NC組比較，miRNA-200a組細胞BRD4和Vimentin的蛋白表達水平顯著下降，E-cadherin的蛋白表達顯著增加(P<0.05)；而在miRNA-200a細胞中過表達BRD4后，與miRNA-200a+pcDNA組比較，Vimentin的蛋白表達水平明顯回升，E-cadherin的蛋白表達呈現下降趨勢，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖3。

圖1 miRNA-200a mRNA相對表達水平比較Fig.1 Comparison of relative mRNA expression of miRNA-200aNote:*.P<0.05.

圖2 A549細胞中miRNA-200a與BRD4靶向關系的驗證Fig.2 Verification of targeting relationship between miRNA-200a and BRD4 in A549 cellsNote:*.P<0.05.

圖3 miRNA-200a過表達對A549細胞EMT蛋白E-cadherin、Vimentin的影響Fig.3 Effect of miRNA-200a overexpression on EMT-related protein E-cadherin,Vimentin in A549 cells

圖4 miRNA-200a過表達對A549細胞侵襲的影響Fig.4 Effect of miRNA-200a overexpression on invasion of A549 cellsNote:*.P<0.05.

2.4miRNA-200a過表達對A549細胞遷移的影響 Transwell實驗顯示，與miRNA-NC組(83.66±9.25)個比較，miRNA-200a組(32.73±6.02)個細胞的遷移數顯著下降(P<0.05)；與miRNA-200a+pcDNA組(35.06±5.89)個比較，miRNA-200a+BRD4組(60.02±7.28)個細胞的遷移數顯著回升，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖4。

3 討論

miRNA-200包括miRNA-141、miRNA-200a、miRNA-200b、miRNA-200c和miRNA-429五個子族，在細胞的增殖、分化、凋亡、EMT、侵襲轉移的調節中起著重要作用[6,7]。大量研究顯示，miRNA-200家族成員在肺癌、結腸癌、乳腺癌等眾多腫瘤中異常表達，并靶向下游基因參與腫瘤侵襲和轉移的調控[8]。miRNA-200a在機體惡性腫瘤中的調控作用不盡相同，如在子宮內膜癌、結腸癌、鼻咽癌中作為癌基因促進癌細胞的增殖、遷移和侵襲，并與腫瘤的分化程度密切相關[9,10]；而在乳腺癌、肝癌、胰腺癌等多種癌組織中表達下調，作為抑癌基因通過靶向不同蛋白抑制腫瘤細胞的EMT、侵襲和轉移[11,12]。本研究結果顯示，miRNA-200a在NSCLC組織中的相對含量顯著低于癌旁組織，提示miRNA-200a可能與NSCLC的發生發展存在密切關系。這一結果在TCGA數據庫中得到進一步驗證。

為了進一步闡明miRNA-200a通過何種途徑參與NSCLC的調控，我們通過生物信息學發現溴化結構蛋白4(bromodomain containing protein 4，BRD4)是miRNA-200a的潛在作用位點。BRD4是溴結構域和超末端結構(bromodomain and extra-terminal domain，BET)蛋白家族成員之一，可通過與組蛋白中乙酰化修飾的賴氨酸特異性結合調控下游基因轉錄、細胞周期和分化、信號轉導等各種生物學過程[13,14]。近期研究表明，BRD4在多種惡性腫瘤中高表達，并參與腫瘤的發生、侵襲和轉移，已成為抗腫瘤治療的重要研究靶點[15]；此外，多項研究已證明BRD4的抑制劑對胰腺癌、乳腺癌、NSCLC、卵巢癌等多種惡性腫瘤具有良好的治療作用[16]。本研究采用熒光素酶檢測實驗證實過表達BRD4-WT 3′UTR后，miRNA-200a組細胞的相對熒光素酶活性顯著低于miRNA-NC組細胞，表明miRNA-200a可負向調控BRD4的表達。

EMT是腫瘤細胞發生侵襲、轉移的重要途徑。腫瘤上皮細胞發生EMT后轉變為高遷移和侵襲能力的間質細胞，離開原發病灶后可進入機體循環系統，從而發生遠處轉移。大量研究證明EMT表型與眾多腫瘤的組織學分級、TNM分期、分化程度和預后密切相關，已成為多種惡性腫瘤靶向治療和預后評估的新靶標[17,18]。EMT是一種動態過程，其發生特征是上皮細胞標志物E-cadherin、ZO-1表達的下調和間質細胞標志物N-cadherin、Fibronectin和Vimentin表達的上調[19]。在我們的研究中，NSCLC細胞過表達miRNA-200a后，其靶基因BRD4和Vimentin的表達顯著下降，E-cadherin的蛋白表達增加；而在miRNA-200a過表達細胞中重新誘導BRD4的表達后，Vimentin的表達水平明顯回升，E-cadherin的表達顯著回落。此外，通過Transwell進一步分析miRNA-200a對NSCLC細胞生物行為學的影響。結果顯示，NSCLC細胞過表達miRNA-200a后，細胞侵襲能力受到顯著抑制；而在miRNA-200a過表達細胞中恢復BRD4的表達后，細胞侵襲能力呈現明顯回升態勢。上述結果表明miRNA-200a可通過靶向下調BRD4的表達抑制NSCLC細胞EMT的發展，從而抑制NSCLC細胞的侵襲和遷移。

綜上所述，miRNA-200a在NSCLC組織中的表達水平顯著降低，miRNA-200a過表達可靶向下調BRD4的表達，并抑制NSCLC細胞中BRD4誘導的EMT和侵襲遷移過程，有望為NSCLC的靶向治療開辟新的思路。