乙肝病毒X蛋白結合蛋白可能通過PI3K/Akt信號通路影響肝癌細胞的增殖和遷移

劉 陽 魏 俊 肖 貝 曾 琴

(武漢市傳染病醫院肺結核科，武漢 430023)

乙肝病毒X蛋白結合蛋白(hepatitis B X-interacting protein，HBXIP)是哺乳動物中一種高度保守的細胞組成型表達蛋白，在惡性腫瘤組織中高表達，作為癌蛋白受到研究者的廣泛關注[1]。已有研究報道，HBXIP在非小細胞肺癌、卵巢癌、膀胱癌等多種惡性腫瘤中高表達，通過影響腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲等促進腫瘤進展，與腫瘤不良預后密切相關[2-4]。肝癌相關研究表明，HBXIP在肝癌組織和癌細胞中高表達與肝癌組織分化、TNM分期及癌栓形成及癌細胞免疫逃逸有關[5,6]。但目前HBXIP對肝癌細胞增殖和遷移的影響及其機制尚未完全闡明。磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)及其下游蛋白激酶B(Akt)所組成的PI3K/Akt信號通路是調節細胞增殖、凋亡、分化和葡萄糖轉運等功能的重要通路，一直是腫瘤細胞增殖、凋亡、遷移等惡性生物學行為的研究熱點[7,8]。本研究分析HBXIP對肝癌細胞增殖和遷移的影響，旨在揭示HBXIP對肝癌細胞增殖和遷移的影響是否與PI3K/Akt信號通路有關。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞株 人正常肝臟細胞HL7702和人肝癌細胞HepG2、Hep3B、Huh7由中國科學院上海細胞庫提供。

1.1.2主要試劑 RPMI1640培養基、胎牛血清(Gibco公司)；青霉素和鏈霉素(Solarbio公司)；pcDNA3.1-HBXIP質粒、siRNA-HBXIP由廣州銳博生物科技有限公司構建；LY294002(PI3K抑制劑，Apexbio公司)；逆轉錄試劑盒(TaKaRa公司)；SYBR Green實時熒光定量PCR試劑盒(ABI公司)；MTT試劑和二甲基亞砜(Solarbio公司)；鼠抗人HBXIP單克隆抗體、兔抗人PI3K單克隆抗體、兔抗人p-PI3K單克隆抗體、兔抗人p-Akt多克隆抗體、兔抗人Akt多克隆抗體、鼠抗人GAPDH單克隆抗體及辣根過氧化酶標記的山羊抗鼠IgG二抗(Abcam公司)。

1.2方法

1.2.1細胞培養 將HL7702、HepG2、Hep3B、Huh7細胞接種于RPMI1640完全培養基(含青霉素100 U/ml、鏈霉素100 μg/ml，10%胎牛血清)，置于37℃、含5%CO2的培養中培養。當細胞90%鋪滿培養瓶后，加入胰酶消化細胞進行傳代培養。

1.2.2qRT-PCR實驗 收集對數生長期的HL7702、HepG2、Hep3B、Huh7細胞，采用TRIzol法抽提細胞總RNA，測定RNA樣品濃度和完整性，使用逆轉錄試劑盒合成cDNA，以cDNA為模板，GAPDH為內參基因，使用SYBR Green實時熒光定量PCR試劑盒進行qPCR反應。HBXIP引物序列：正向5′-ATGGAGCCAGGTGCAGGTC-3′，反向5′-TGGAGGGATTCTTCATTGTG-3′；GAPDH引物序列：上游5′-ATCCCATCACCATCTTCC-3′，下游5′-TCCTTCCACGATACCAAA-3′。結果采用2-ΔΔCt法計算HBXIP mRNA相對表達水平。

1.2.3細胞轉染 選擇肝癌細胞HepG2進行后續實驗。收集對數生長期的肝癌細胞，制成單細胞懸液并以2×105個/孔接種于6孔板，放入培養箱中培養，當細胞融合50%～70%時，將pcDNA3.1-HBXIP質粒、siRNA-HBXIP轉染細胞，轉染36 h后檢測轉染效率，另將轉染pcDNA3.1空載體、siRNA陰性對照及未轉染的細胞作為對照，分別記為pcDNA-HBXIP組、si-HBXIP組、pcDNA組、si-NC組和空白組。每組設5個重復孔重復3次實驗。

1.2.4MTT實驗 收集對數生長期的空白組和穩定轉染的pcDNA組、pcDNA-HBXIP組、si-NC組和si-HBXIP組肝癌細胞，制成單細胞懸液并以1×104個/孔接種于96孔板(加入或不加入LY294002處理)，放入培養箱中培養，分別于0 h、24 h、48 h和72 h時，以20 μl/孔加入5 mg/ml的MTT溶液繼續培養4 h，吸除孔內液體，以150 μl/孔加入二甲基亞砜溶液振蕩反應5 min。使用酶標儀測定每孔490 nm 波長處吸光度值。

1.2.5細胞劃痕實驗 收集對數生長期的空白組和穩定轉染的pcDNA組、pcDNA-HBXIP組、si-NC組和si-HBXIP組肝癌細胞，制成密度為5×105個/ml的單細胞懸液，以500 μl/孔鋪于6孔板上，加入RPMI1640完全培養液培養至形成單層細胞。用10 μl無菌槍頭在單層細胞上劃痕，PBS溶液清洗3次，加入40 μg/ml的無氟尿嘧啶溶液孵育24 h，更換RMPI1640完全培養液繼續培養24 h。吸去培養液，PBS溶液清洗3次，倒置顯微鏡下觀察并拍照。細胞遷移率(%)=(初次劃痕面積-末次觀察時劃痕面積)/初次劃痕面積×100%。

1.2.6Western blot實驗 收集對數生長期的HL7702、HepG2、Hep3B、Huh7細胞及轉染各組細胞，加入RIPA裂解液對細胞進行裂解，BCA法測定每個蛋白樣品的濃度。向蛋白樣品中加入5倍的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液混勻，放入沸水浴中加入5 min使蛋白充分變性，蛋白樣品冷卻后進行SDS-PAGE電泳。電泳結束后使用Bio-Rad濕式轉膜裝置將目的蛋白轉移至PVDF膜，洗膜1～2 min，加入5%脫脂奶粉中封閉1 h。加入1∶1 000稀釋的鼠抗人HBXIP單克隆抗體、兔抗人PI3K單克隆抗體、兔抗人p-PI3K單克隆抗體、兔抗人p-Akt多克隆抗體、兔抗人Akt多克隆抗體、鼠抗人GAPDH單克隆抗體4℃孵育過夜，洗膜1～2 min，加入1∶2 000 稀釋的辣根過氧化酶標記的山羊抗鼠IgG二抗室溫孵育2 h。洗膜，加入ECL溶液顯色，曝光、拍照，應用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值并計算目的蛋白相對表達量。

2 結果

2.1HBXIP在人正常肝細胞株及肝癌細胞株中表達 與人正常肝細胞株HL7702比較，肝癌細胞株HepG2、Hep3B、Huh7中HBXIP mRNA相對表達水平均明顯升高(P<0.05，圖1A)，HBXIP蛋白相對表達水平均明顯升高(P<0.05，圖1B)。

2.2HBXIP過表達對肝癌細胞HepG2增殖的影響 與空白組和pcDNA組比較，pcDNA-HBXIP組肝癌細胞中HBXIP蛋白相對表達量明顯升高(P<0.05，圖2A)；MTT實驗結果，與空白組和pcDNA組比較，pcDNA-HBXIP組肝癌細胞在培養48 h和 72 h 時增殖活性明顯增強(P<0.05，圖2B)。說明過表達HBXIP促進肝癌細胞增殖。

圖1 HBXIP在人正常肝細胞株及肝癌細胞株中表達Fig.1 HBXIP expression in human normal liver cell lines and liver cancer cell linesNote: Compared with HL7702 cell,*.P<0.05.

圖2 HBXIP過表達對肝癌細胞HepG2增殖的影響Fig.2 Effect of HBXIP overexpression on proliferation of HepG2 cellsNote: Compared with blank group and pcDNA group,*.P<0.05.

2.3HBXIP過表達對肝癌細胞HepG2遷移的影響 劃痕實驗結果，空白組、pcDNA組和pcDNA-HBXIP組肝癌細胞遷移率分別為(33.82±2.79)%、(32.74±2.58)%、(58.17±4.11)%。與空白組和pcDNA組比較，pcDNA-HBXIP組肝癌細胞遷移率明顯升高(P<0.05)，說明過表達HBXIP促進肝癌細胞遷移(圖3)。

2.4沉默HBXIP對肝癌細胞HepG2增殖和遷移的影響 與空白組和si-NC組比較，si-HBXIP組肝癌細胞中HBXIP蛋白表達明顯降低(P<0.05，圖4A)，培養48 h和72 h時細胞增殖活性明顯降低(P<0.05，圖4B)；空白組、si-NC組和si-HBXIP組肝癌細胞遷移率分別為(33.75±2.81)%、(33.16±2.43)%、(18.17±1.35)%，si-HBXIP組肝癌細胞遷移率較空白組、si-NC組明顯降低(P<0.05，圖4C)。說明沉默HBXIP能夠抑制肝癌細胞增殖和遷移。

2.5HBXIP過表達對肝癌細胞HepG2中PI3K/Akt信號通路的影響 與空白組和pcDNA組比較，pcD-NAHBXIP組肝癌細胞中p-PI3K和p-Akt蛋白相對表達水平明顯升高(P<0.05)，PI3K和Akt蛋白相對表達水平差異無統計學意義(P>0.05,圖5)。

圖3 劃痕實驗檢測肝癌細胞遷移能力Fig.3 Scratch test to detect liver cancer cell migrationability

圖4 沉默HBXIP對肝癌細胞HepG2增殖和遷移的影響Fig.4 Effect of silencing HBXIP on proliferation and migration of HepG2 cellsNote: Compared with blank group and siNC group,*.P<0.05.

圖5 HBXIP過表達對肝癌細胞HepG2中PI3K/Akt通路的影響Fig.5 Effect of HBXIP overexpression on PI3K/Akt pathway of HepG2 cellsNote: Compared with blank group and pcDNA group,*.P<0.05.

圖6 LY294002對過表達HBXIP的肝癌細胞增殖和遷移的影響Fig.6 Effect of LY294002 on proliferation and migration of hepatoma cells overexpressing HBXIPNote: Compared with blank group and pcDNA group,*.P<0.05;compared with pcDNA-HBXIP group,#.P<0.05.

2.6LY294002對過表達HBXIP的肝癌細胞增殖和遷移的影響 與pcDNA-HBXIP組比較，pcDNA-HBXIP+LY294002組肝癌細胞增殖活性明顯受到抑制(P<0.05，圖6A)，細胞遷移率明顯降低(P<0.05，圖6B)。說明阻斷PI3K/Akt信號通路能夠逆轉過表達HBXIP對肝癌細胞增殖和遷移能力的促進作用。

3 討論

肝癌是威脅全球人類健康的主要惡性腫瘤之一，2014年中國分地區惡性腫瘤發病和死亡分析報告顯示[9]，肝癌在我國中、東、西部地區死亡率均居第2位。肝癌預后危險因素分析表明，腫瘤大小、血管侵犯、淋巴結轉移是影響肝癌預后的獨立危險因素[10,11]。控制癌細胞增殖和遷移對肝癌臨床治療及預后改善具有重要意義。

人的HBXIP基因定位于染色體1p13.3，編碼分子量約19 kD的蛋白。最初認為HBXIP與乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)的C末端結合，作為癌蛋白在控制細胞增殖、凋亡和分裂中發揮作用。近年來越來越多的研究關注HBXIP在癌癥發生及進展中的分子機制，HBXIP在乳腺癌中高表達，通過激活轉錄因子Sp1上調成纖維細胞生長因子4(FGF4)促進乳腺癌細胞遷移，通過轉錄因子E2F1誘導PKM2上調表達促進乳腺癌細胞增殖[12,13]。HBXIP通過激活轉錄因子c-Myb上調Hippo通路下游效應蛋白YAP，促進肝癌生長[14]。提示HBXIP作為一種癌蛋白可通過調節癌相關轉錄因子表達激活癌癥細胞生長相關通路，進而促進癌癥進展。

本研究結果表明，HBXIP在肝癌細胞株HepG2、Hep3B、Huh7中均高表達，以肝癌HepG2細胞為研究對象，構建過表達HBXIP和抑制表達HBXIP的肝癌細胞，發現過表達HBXIP明顯促進肝癌細胞增殖和遷移，而抑制HBXIP表達后肝癌細胞增殖和遷移能力明顯降低。說明HBXIP在肝癌細胞中高表達對細胞增殖和遷移具有促進作用，抑制HBXIP可能是肝癌的潛在治療靶點。

PI3K/Akt信號通路是真核細胞中重要的信號轉導通路之一，通過影響下游多種效應因子的活化狀態在促進細胞增殖、抑制細胞凋亡、促進腫瘤耐藥等多種生物過程中起關鍵作用[15-17]。HBXIP基因過表達促進腺樣囊性癌細胞株ACC-M增殖、遷移和侵襲，其作用機制可能與促進PI3K、Akt磷酸化有關[18]。本研究結果發現，HBXIP在肝癌細胞中過表達后細胞中PI3K和Akt總體水平無明顯變化，但p-PI3K、p-Akt蛋白表達明顯升高，說明HBXIP在肝癌細胞中高表達能夠促進PI3K、Akt磷酸化，即激活PI3K/Akt信號通路。有研究表明，PI3K/Akt信號通路在維持HepG2細胞中腫瘤干細胞比例及特性中起重要作用，是肝癌對索拉菲尼耐藥的重要因素，也是調節肝癌細胞生長、增殖、遷移和侵襲的重要機制[19-21]。為證實HBXIP促進肝癌細胞增殖和遷移的作用是否與激活PI3K/Akt信號通路有關，本研究用LY294002阻斷PI3K/Akt信號通路，發現過表達HBXIP的肝癌細胞增殖和遷移能力明顯降低，說明與腺樣囊性癌細胞中一樣，HBXIP對肝癌細胞增殖和遷移的促進作用與PI3K/Akt信號通路有關。

綜上所述，本研究初步證明HBXIP在肝癌細胞中高表達，可能通過激活PI3K/Akt信號通路促進肝癌細胞增殖和遷移，提示靶向干擾HBXIP的表達可能對改善肝癌預后具有積極意義。但該作用途徑中的具體分子機制仍需進一步深入探討。