靶向沉默c-Met基因對膀胱癌T24細胞放射敏感性的影響及其機制研究

李建偉 田文靜 劉 民

(滄州市中心醫院泌尿外二科，滄州 061001)

膀胱癌又稱膀胱尿路上皮癌，是發生在膀胱黏膜上常見的泌尿系統惡性腫瘤，也是全球第九大常見腫瘤[1]。目前治療膀胱癌的主要方式是手術聯合放射治療，但由于膀胱癌患者對放療不敏感導致患者預后不良[2]。因此，有效提高膀胱癌患者的放射敏感性變得十分迫切。c-Met是肝細胞生長因子受體，在多數惡性腫瘤中呈高表達[3-5]。臨床研究發現，c-Met的高表達與腫瘤患者預后不良密切相關[6]。目前，c-Met在調控腫瘤細胞放射敏感性的研究備受人們關注[7,8]。近期研究發現，c-Met在膀胱癌組織亦呈高表達，可能與膀胱癌的臨床分期、病理分級及淋巴結轉移有關[9]。但c-Met是否參與膀胱癌患者放射敏感性的研究目前尚未見報道。因此本實驗通過小干擾RNA技術靶向沉默c-Met基因表達，旨在觀察c-Met siRNA對膀胱癌T24細胞放射敏感性的影響，并探討其作用機制，以期為膀胱癌的放射治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1材料 人膀胱癌T24細胞(武漢大學中國典型培養物保藏中心)；RPIM1640培養基、胎牛血清(美國HyClone公司)；噻唑藍(Methylthiazolyl-diphenyl-tetrazolium bromide，MTT)試劑(美國Invitrogen公司)；胰蛋白酶(杭州四季青生物工程材料有限公司)；Trizol試劑、Lipofectamine 2000轉染試劑(美國Invitrogen公司)；特異性c-Met siRNA1、c-Met siRNA2及非特異性c-Met siRNA(上海吉瑪制藥技術有限公司)；Cleaved Caspase-3抗體、Bax抗體、PI3K抗體和p-AKT抗體及二抗(美國CST公司)；逆轉錄試劑盒(北京康為試劑有限公司)；SYBR premix Ex Taq PCR Kit熒光定量PCR檢測試劑盒(日本TaKaRa公司)；細胞裂解液、BCA蛋白濃度檢測試劑盒(上海碧云天生物技術研究所)；Annexin-Ⅴ/PI細胞凋亡檢測試劑盒(美國BD公司)。

1.2方法

1.2.1細胞培養和轉染 人膀胱癌T24細胞培養條件為：含10%胎牛血清的RPIM1640培養基(內含有100 U/ml青霉素和鏈霉素)，5%CO2、37℃恒溫培養箱中培養。取生長狀態良好的T24細胞接種到96孔板中，待細胞生長匯合至40%左右時，按照Lipofectamine 2000轉染試劑說明書進行轉染操作，以轉染特異性c-Met siRNA1的T24細胞為si-c-Met1組，以轉染特異性c-Met siRNA2的T24細胞為si-c-Met2組，以轉染非特異性c-Met siRNA的T24細胞為NC組，同時設置空白對照組(Blank組)。轉染后將各組細胞置37℃培養箱繼續培養。

1.2.2qRT-PCR檢測各組T24細胞中c-Met基因mRNA表達情況 收集轉染48 h后的各組T24細胞，Trizol法提取RNA，按照逆轉錄試劑盒說明書合成cDNA，以SYBR premix Ex Taq PCR Kit熒光定量PCR檢測試劑盒進行擴增，采用20 μl反應體系：cDNA 1 μl，上下游引物各0.8 μl，2×SYBR premix Ex Taq PCR Mix 10 μl，由ddH2O補齊20 μl。反應條件為：95℃ 5 min，95℃ 15 s，58℃ 30 s，72℃ 20 s，共40個循環。以β-actin為內參，實驗重復3次，采用2-ΔΔCT法檢測各組T24細胞中c-Met mRNA相對表達量。

1.2.3Western blot檢測各組T24細胞中c-Met蛋白表達情況 收集轉染48 h后的各組T24細胞，加入蛋白裂解液置冰上提取細胞中總蛋白，采用BCA蛋白濃度檢測試劑盒對蛋白定量測定，取等量變性蛋白樣品行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，通過電轉法轉膜至PVDF膜上，置5%脫脂奶粉中封閉2 h，加入一抗(c-Met一抗稀釋比為1∶1 000)雜交，4℃雜交過夜，TBST洗膜3次，加入二抗(二抗稀釋比為1∶3 000)雜交，室溫雜交2 h，TBST洗膜3次，ECL化學發光，以GAPDH標定，使用Image J軟件分析圖像，計算各組T24細胞中c-Met蛋白相對表達量。

1.2.4MTT檢測各組T24細胞增殖情況 各組T24細胞在轉染24、48、72 h，分別向細胞中加入20 μl MTT溶液，37℃孵育4 h，取出細胞培養板，取上清，再向細胞中添加100 μl二甲基亞砜，振蕩反應10 min，沉淀完全溶解后，使用全自動酶標儀測定細胞在450 nm波長處吸光度值(A值)。

1.2.5克隆形成實驗檢測T24細胞克隆形成能力 各組T24細胞以胰蛋白酶消化成單個細胞，計數后稀釋備用。在6孔板中種植200個細胞，置37℃培養箱繼續培養24 h，室溫下給予6 MeV電子線照射，照射劑量分別為0、2、4、6、8 Gy，照射后繼續培養14 d，以甲醇固定15 min，結晶紫染色30 min，洗去染液后，在顯微鏡下計數>50個細胞克隆數?？寺⌒纬陕?%)=克隆形成數/接種細胞數×100%，存活分數(SF)=照射克隆形成率/對照克隆形成率，采用線性二次模型計算發射生物學參數，并擬合劑量存活曲線，實驗進行3次獨立重復實驗，取均值。

1.2.6流式細胞術檢測照射后各組T24細胞凋亡情況 分別收集經0 Gy和4 Gy照射后的各組T24細胞，用胰蛋白酶消化成單個細胞，收集細胞，PBS洗滌細胞2次，以Binding Buffer重懸細胞，在細胞懸液中依次加入Annexin-Ⅴ和PI各5 μl，輕輕混勻，室溫下避光孵育15 min，立即上流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.2.7Western blot檢測照射后各組T24細胞Cleaved Caspase-3、Bax、PI3K和p-AKT蛋白表達情況 收集經4 Gy照射后的各組T24細胞，加入細胞裂解液提取蛋白，其中Cleaved Caspase-3一抗稀釋比為1∶800，Bax一抗稀釋比為1∶800，PI3K一抗稀釋比為1∶1 000，p-AKT一抗稀釋比為1∶1 000，其余步驟同1.2.3。

2 結果

2.1轉染特異性c-Met siRNA對膀胱癌T24細胞中c-Met表達的影響 qRT-PCR檢測結果顯示，轉染c-Met siRNA1和c-Met siRNA2的T24細胞中c-Met mRNA相對表達量較Blank組均有不同程度的降低(P<0.05)，si-c-Met2組下降尤為明顯，NC組和Blank組間c-Met mRNA相對表達量差異無統計學意義(P>0.05)。Western blot檢測同樣顯示，與Blank組比，si-c-Met1組和si-c-Met2組c-Met蛋白表達水平均顯著下調(P<0.05)，si-c-Met2組c-Met蛋白表達水平下調較明顯，而NC組和Blank組相比，c-Met蛋白表達水平差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1和表1。si-c-Met2對膀胱癌T24細胞中c-Met的靶向沉默作用更顯著，因此選擇si-c-Met2進行后續研究。

2.2沉默c-Met基因對T24細胞增殖能力的影響 MTT法檢測Blank組、NC組和si-c-Met2組T24細胞轉染24、48、72 h的A值，結果見表2所示，3組間相同時間點的A值比較，差異無統計學意義(P>0.05)。說明靶向沉默c-Met基因對膀胱癌T24細胞的增殖能力無較大影響。

圖1 Western blot檢測各組膀胱癌T24細胞中c-Met蛋白表達情況Fig.1 Western blot analysis of c-Met protein expression in bladder cancer T24 cells

2.3沉默c-Met基因增強T24細胞對放射的敏感性 克隆形成實驗結果所示，與Blank組相比，4、6、8、10 Gy劑量照射后si-c-Met2組T24細胞克隆形成數明顯減少(P<0.05)。而Blank組和NC組間細胞克隆形成數無明顯改變(P>0.05)。Blank組、NC組和si-c-Met2組D0值分別為：5.91、5.89和3.65，SF2值分別為：0.85、0.84和0.61。與Blank組相比，si-c-Met2組T24細胞D0值和SF2值均明顯降低，而Blank組和NC組相比，D0值和SF2值均無明顯改變(P>0.05)。以線性二次模型擬合各組T24細胞劑量存活曲線，見表3和圖2。表明靶向沉默c-Met基因能夠增強膀胱癌T24細胞的放射敏感性。

2.4沉默c-Met基因提高照射條件下T24細胞的凋亡率 各組T24細胞接受0 Gy和4 Gy照射后，使用流式細胞儀檢測細胞凋亡率，結果顯示，Blank組、NC組和si-c-Met2組接受0 Gy時細胞凋亡率分別為：(3.01±1.38)%、(3.22±2.40)%、(8.08±3.83)%，各組細胞凋亡率比較無顯著差異(P>0.05)。接受4 Gy時細胞凋亡率分別為：(20.36±2.08)%、 (21.17±2.98)%、 (48.79±6.11)%，si-c-Met2組細胞凋亡率明顯高于Blank組(P<0.05)，而Blank組和NC組比較差異不顯著(P>0.05)。提示放射時靶向沉默c-Met2基因可促進T24細胞凋亡。見圖3和表4。

Groupsc-Met mRNAc-Met proteinBlank1.00±0.100.24±0.03NC0.94±0.090.21±0.02si-c-Met10.52±0.051)0.11±0.011)si-c-Met20.23±0.021)0.04±0.011)F75.78667.733P0.0000.000

Note:Compared with the blank group,1)P<0.05.

GroupsA value(λ=450)24 h48 h72 hBlank0.45±0.040.64±0.060.81±0.08NC0.43±0.040.62±0.050.80±0.08si-c-Met20.42±0.040.59±0.060.76±0.07F0.4380.5880.356P0.6650.5850.714

Note:Compared with the blank group,1)P<0.05.

圖3 流式細胞儀檢測各組T24細胞凋亡率Fig.3 Flow cytometry to detect apoptosis rate of T24 cells in each group

Groups0 Gy4 GyBlank3.01±1.3820.36±2.08NC3.22±2.4021.17±2.98si-c-Met28.08±3.8348.79±6.111)F3.31646.651P0.1070.000

Note:Compared with the blank group,1)P<0.05.

圖4 Western blot檢測T24細胞中蛋白表達情況Fig.4 Western blot analysis of protein expression in T24 cells

GroupsCleaved Caspase-3BaxPI3Kp-AKTBlank0.21±0.020.15±0.021.50±0.161.28±0.14NC0.20±0.020.14±0.021.47±0.151.25±0.13si-c-Met20.79±0.081)0.47±0.051)0.42±0.041)0.31±0.041)F142.62596.09168.50571.866P0.0000.0000.0000.000

Note:Compared with the blank group,1)P<0.05.

2.5沉默c-Met基因對照射條件下T24細胞中蛋白表達的影響 Western blot檢測接受4 Gy放射后各組T24細胞中Cleaved Caspase-3、Bax、PI3K和p-AKT，結果如圖4和表5所示，與Blank組比，si-c-Met2組T24細胞中Cleaved Caspase-3和Bax蛋白表達顯著上調(P<0.05)，PI3K和p-AKT蛋白表達顯著下調(P<0.05)，而Blank組和NC組各蛋白表達量比較差異不顯著(P>0.05)。提示放射條件下靶向沉默c-Met2基因可上調T24細胞中Cleaved Caspase-3和Bax的表達，下調PI3K和p-AKT的表達。

3 討論

膀胱癌的發病率在我國一直高居泌尿系統惡性腫瘤首位，嚴重影響著人們的身心健康[10]。膀胱癌患者術后易出現復發，導致患者預后不良，放射治療作為術后防治腫瘤復發常用的輔助治療手段而備受關注。但是，部分患者對放療不敏感大大限制了其效果，因此增強膀胱癌的放射敏感性對膀胱癌的臨床治療尤為重要。c-Met基因編碼的肝細胞生長因子受體是一種酪氨酸激酶，是酪氨酸激酶受體家族重要成員之一，能夠通過招募下游信號分子激活磷酸化級聯反應，引起一系列生物學效應[11,12]。研究發現，c-Met在多種癌組織中呈過表達，如食管癌、骨肉瘤和前列腺癌等，且可以調節癌癥中的腫瘤生長、轉移和存活[13-15]。前期研究檢測到c-Met在膀胱癌組織中亦呈高表達。因此本實驗在膀胱癌T24細胞中轉染c-Met siRNA靶向沉默c-Met基因，經qRT-PCR和Western blot檢測轉染效果，發現轉染c-Met siRNA能夠有效靶向沉默c-Met基因。報道顯示，c-Met還與各種腫瘤中的放射抗性有關[16,17]。關于腫瘤放射敏感性的具體機制目前尚不完全清楚，但研究顯示，抑制細胞增殖、誘導細胞凋亡與增強放射敏感性緊密相關[18,19]。例如，c-Met敲低可通過破壞端粒穩態和抑制DNA損傷的修復來促進乳腺癌細胞的放射敏感性[20]。然而，c-Met基因是否參與膀胱癌細胞對放療敏感性的研究尚無相關報道。因此本實驗通過沉默c-Met基因探討對膀胱癌放射敏感性的影響和潛在機制。

本實驗結果表明，靶向沉默c-Met基因對T24細胞增殖能力無顯著影響，而經放射線照射后，沉默c-Met基因的T24細胞克隆形成數目顯著降低，細胞存活數減少。細胞凋亡是由一系列凋亡相關基因誘導的細胞自主有序的細胞過程。其中Bax是Bcl-2基因家族促進細胞凋亡的基因，其過度激活可促進細胞趨于死亡[21]。Caspase-3是細胞凋亡過程中關鍵蛋白酶，其激活形式Cleaved Caspase-3可促進細胞發生凋亡[22]。流式細胞儀檢測結果顯示，經4 Gy照射后沉默c-Met基因的細胞凋亡率顯著高于對照組細胞。Western blot檢測結果顯示，經放射后各組細胞中Cleaved Caspase-3和Bax蛋白表達明顯上調，提示沉默c-Met基因誘導的細胞凋亡與上調Cleaved Caspase-3和Bax的表達有關。本實驗結果提示，沉默c-Met基因可通過促進放射誘導的細胞增殖抑制，增加放射誘導的細胞凋亡來增強膀胱癌T24細胞放射敏感性。為進一步探討沉默c-Met基因調節膀胱癌的放射敏感性的機制，本實驗通過Western blot檢測了經放射后各組細胞中PI3K和p-AKT蛋白表達情況，結果顯示，沉默c-Met基因的T24細胞中PI3K和p-AKT蛋白表達顯著下調。PI3K是磷脂酰肌醇激酶，其激活可促進AKT的激活和轉位，而PI3K和AKT異常表達可過度激活PI3K/AKT信號通路。研究表明，PI3K/AKT信號通路的過度激活降低腫瘤細胞放射敏感性[23,24]。通過阻斷PI3K/AKT信號通路的活化來增強腫瘤細胞對放射的敏感性。Chen等[25]研究發現，Foretinib通過抑制c-Met的磷酸化并激活下游PI3K/AKT等信號傳導途徑來增強食管鱗狀細胞癌的放射敏感性。據此提示靶向沉默c-Met基因可能通過抑制PI3K/AKT信號通路的激活增強膀胱癌T24細胞對放射的敏感性。

綜上，本研究表明靶向沉默c-Met基因可增加膀胱癌T24細胞放射敏感性，其可能的作用機制與抑制PI3K/AKT信號通路的激活有關，本實驗為膀胱癌放射治療提供新的作用靶點。