原發性肝癌患者循環miR-203a-3p表達水平與SOCS1和SOCS3的關系及意義①

劉 敏 王 閣

(新疆兵團醫院腫瘤科，烏魯木齊 830000)

肝癌作為世界第五大最為常見的癌癥，每年的新發肝癌病例和死亡病例均超過7 000萬例[1]。血液檢查和影像學檢測是目前普查肝癌的主要手段，由于患者早期癥狀不典型且病程發展快，臨床上大約有80%的患者發現時已處于晚期，錯失了最佳手術時機。機體內基因異常表達一般先于腫瘤的發生，因此從基因水平上尋求一種更為靈敏的肝癌早期診斷生物學標記物成為本領域研究的熱點，微小RNA(microRNA，miR)在腫瘤性疾病中一般被作為抑癌基因或原癌基因加以研究，是近幾年的研究熱點。細胞因子信號抑制物(suppres-sor of cytokine signaling,SOCS)是一種細胞因子信號傳導抑制因子，可通過負反饋抑制多條信號通路，是JAK-STAT信號轉導通路中的重要抑制因子，可通過抑制JAK-STAT信號轉導發揮抗腫瘤作用。現有研究已證實，肝癌病灶組織中SOCS家族的SOCS1和SOCS3均呈低表達，SOCS1和SOCS3的啟動子異常甲基化是沉默其表達和誘發腫瘤的一個重要原因，可預測疾病嚴重程度及患者預后[2-4]。有研究證實SOCS1和SOCS3均是miR-203a-3p的靶基因[5,6]，本研究分析循環miR-203a-3p表達與組織SOCS1、SOCS3的關系，為肝癌的臨床診治提供新靶點。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1一般資料 選取我院2017年5月至2018年5月收治的50例原發性肝癌患者作為研究組，其中男31例，女19例，年齡37～71歲，平均(51.23±4.36)歲。另招募50例健康體檢者作為對照組，其中男26例，女24例，年齡35～73歲，平均年齡(53.14±5.23)歲。兩組患者的年齡和性別差異無統計學意義(P>0.05)。研究組納入標準：首次診出為原發性肝癌，無既往治療史；近6個月內無免疫調節史；自愿簽署知情同意書。本研究經本院倫理委員會批準。

1.1.2試劑與儀器 namodropND-1000分光光度計購自美國Thermo公司；PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit購自大連TaKaRa公司；GoTaq?qPCR Master Mix試劑盒購自德國Promega公司；ABI 7500型實時熒光定量PCR擴增儀購自美國ABI公司；miR-203a-3p引物、小鼠抗SOCS3單克隆抗體、核酸提取試劑盒、HRP標記山羊抗兔IgG和山羊抗小鼠IgM購自生工生物工程(上海)股份有限公司；兔抗SOCS1單克隆抗體購自美國Abnova公司；EZ DNA Methylation-GoldTMKit購自美國ZYMO RESEARCH公司。

1.2方法

1.2.1樣本提取方法 50例肝癌患者于確診后，治療前抽取晨8:00時外周肘靜脈血，即刻送檢；于手術過程中留取肝癌組織和癌旁2 cm以上的健康組織，-70℃保存。50例健康志愿者于體檢時抽取晨8:00時外周肘靜脈血，即刻送檢。

1.2.2循環miR-203a-3p表達測定方法 Trizol裂解法提取研究組和對照組全血樣本總RNA，用nanodropND-1000分光光度計檢測RNA濃度和純度，用于后續實驗。實時熒光定量PCR實驗檢測miR-203a-3p表達，主要步驟：①所得總RNA樣本，使用PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit反轉錄生成cDNA。②使用GoTaq?qPCR Master Mix試劑盒和ABI 7500型實時熒光定量PCR擴增儀檢測miR-203a-3p表達。miR-203a-3p引物上游序列：5′-CCGGTGAAATGTTTAGGACCACTAG-3′；下游序列：5′-GCCGCGTGAAATGTTTAGG-3′；內參為U6。③每個樣本的目的基因做3個重復，取平均Ct值根據公式：n=2-ΔΔCt計算miR-203a-3p表達量。

1.2.3組織SOCS1和SOCS3的蛋白表達測定 采用免疫蛋白印跡實驗(Western blot)檢測病灶組織和癌旁組織SOCS1和SOCS3的蛋白表達，主要步驟：① 使用裂解液(RIPA∶PMSF=100∶1)裂解凍存的肝組織，充分裂解后將裂解液轉移至新的離心管中，4℃ 12 000 r/min離心5 min，取上清轉移至新的1.5 ml離心管中，保存于-20℃備用。② 使用BCA法測定蛋白質含量。③進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。④ 80 V恒壓轉膜1 h；室溫條件下5%的脫脂奶粉封閉60 min；分別加入兔抗SOCS1單克隆抗體和小鼠抗SOCS3單克隆抗體，4℃孵育過夜；分別加入HRP標記山羊抗兔IgG和山羊抗小鼠IgM，室溫孵育90 min。⑤曝光、顯影、定影。顯影后掃描膠片，用Image J圖像分析軟件分析條帶灰度值，以各組條帶灰度值與β-actin條帶灰度值的比值，代表各組蛋白相對表達量。

1.2.4組織SOCS1和SOCS3甲基化程度測定方法 采用核酸提取試劑盒提取病灶組織和癌旁組織的基因組DNA。采用EZ DNA Methylation-GoldTMKit試劑盒，對基因組 DNA 進行亞硫酸氫鹽處理，嚴格按照試劑盒的說明進行操作。目的基因SOCS1、SOCS3和內參基因β-actin使用Premier 5.0設計引物。陽性對照、陰性對照以及空白對照分別為Human Methylated DNA、Human Non-methylated DNA以及雙蒸水。PCR產物的電泳采用1.5%的瓊脂糖凝膠，電泳后在溴化乙錠溶液中染15 min，最后在凝膠成像儀中觀察并分析電泳圖。

2 結果

2.1循環miR-203a-3p的表達水平 研究組循環miR-203a-3p的表達水平為0.829±0.208，對照組為1.596±0.304，研究組低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1。

2.2組織SOCS1和SOCS3蛋白表達水平 研究組病灶組織的SOCS1和SOCS3蛋白表達水平分別為0.825±0.322和0.624±0.200，癌旁組織分別為0.285±0.096和0.352±0.185，病灶組織均低于癌旁組織，差異有統計學意義(P<0.05)；見圖2。

圖2 組織SOCS1和SOCS3蛋白表達水平比較Fig.2 Comparison in protein expression level of SOCS1 and SOCS3Note: A.Protein expression of SOCS1.The left figure is the Western blot sample.The right figure is the histogram of 50 patients；B.Protein expression of SOCS3.The left figure is the Western blot sample.The right figure is the histogram of 50 patients.

2.3組織SOCS1和SOCS3基因甲基化水平 研究組病灶組織的SOCS1和SOCS3甲基化表達水平分別為0.805±0.062和0.652±0.062，癌旁組織分別為0.105±0.026和0.154±0.026，病灶組織甲基化表達水平均高于癌旁組織，差異有統計學意義(P<0.05)；研究組病灶組織的SOCS1和SOCS3非甲基化表達水平分別為0.012±0.002和0.013±0.003，癌旁組織分別為0.352±0.046和0.285±0.085，病灶組織非甲基化表達水平均低于癌旁組織，差異有統計學意義(P<0.05)；見圖3。

2.4循環miR-203a-3p與SOCS1和SOCS3表達水平的相關性分析 肝癌患者血清循環miR-203a-3p表達水平與肝癌組織SOCS1和SOCS3蛋白表達水平呈正相關性(r=0.576、0.475，P<0.05)；與SOCS1和SOCS3基因甲基化程度呈負相關性(r=-0.585、-0.579，P<0.05)；其相關直線如圖4所示。

圖3 組織SOCS1和SOCS3基因甲基化水平比較Fig.3 Comparison in methylation level of tissue SOCS1 and SOCS3Note: A.Methylation expression of SOCS1,the above diagram is the MSP experimental sample (M represents methylation expression,U represents non-methylation expression).The below diagram is the histogram of 50 patients；B.Methylation expression of SOCS3,the above diagram is the MSP experimental sample (M represents methylation expression,U represents non-methylation express-ion).The below diagram is the histogram of 50 patients.

圖4 血清循環miR-203a-3p表達水平與各個指標的相關直線Fig.4 Correlation line between expression level of serum circulating miR-203a-3p and various indicatorsNote: A.Circulating miR-203a-3p expression and SOCS1 protein expression in liver cancer patients;B.Circulating miR-203a-3p expression and the SOCS3 protein expression in cancer tissues；C.Circulating miR-203a-3p expression and SOCS1 methylation expression in cancer tissues；D.Circulating miR-203a-3p expression and SOCS3 methylation expression in cancer tissues.

3 討論

肝癌是全球發病率最高的癌癥之一，由于其發病前期癥狀不明顯，病情發展較快，因此給肝癌患者的早期診斷和及時有效治療帶來了一定的難度。為了實現肝癌患者的早期診斷和更好的治療，明確肝癌的發病機制非常關鍵，本研究探討了肝癌組織中循環miR-203a-3p表達水平與SOCS1和SOCS3表達水平及其甲基化水平的關系，以期為完善肝癌發病機制和為尋求一種早期診斷肝癌的靈敏指標奠定一定的基礎。

miR-203在多種腫瘤中具有促進細胞凋亡的作用，抑制miR-203表達可促進Hela細胞增殖，重新表達可抑制Hela細胞增殖[7-9]。Furuta等[10]研究證實miR-203在肝癌組織中表達水平明顯下調，而用甲基化酶抑制劑5-氮雜-2脫氧胞苷處理后可恢復miR-203的表達水平，說明其下調可能是由甲基化所致；上調肝癌細胞miR-203表達水平可抑制細胞的生長，推測miR-203是一種新型的肝癌表觀遺傳學沉默腫瘤抑制miRNAs[11，12]。miR-203a-3p與miR-203高度同源，在肝癌患者中可能也具有抑癌作用。SOCS1和SOCS3屬SOCS家族的成員，是由細胞產生并能夠反饋性阻斷細胞因子信號轉導過程的負性調節因子，可抑制Janus 酪氨酸激酶-信號傳導子及轉錄激活子(Janus tyrosine kinase-signal transducer and activator of transcription,JAK-STAT)信號通路異常激活引發的細胞增殖。王紅雷等[13]應用對比分析了肝細胞癌組織和正常肝組織中的SOCS3表達，發現SOCS3在癌組織中表達水平下調，且其具體水平與腫瘤大小、分化程度以及患者的生存期有關。進一步研究表明，SOCS3啟動子區甲基化是導致SOCS3表達沉默和腫瘤活動增強的一個重要原因，在針對乙肝病毒(HBV)相關性肝癌和原發性肝癌的臨床研究中均發現了類似情況[14，15]。符常波等[16]發現SOCS1低表達與肝癌的發生、發展和轉移有關，SOCS1失活會導致JAK-STAT信號通路過度持續激活，腫瘤細胞侵襲性增加和病情惡化，Gui等[17]也得出了相仿的結論，認為SOCS1的甲基化程度與肝癌患者的預后密切相關。Zhang等[18]發現SOCS1在乙肝病毒(HBV)相關性肝癌的病灶組織和正常組織均有陽性表達，且病灶組織中的甲基化狀態增強，并指出SOCS1的甲基化削弱了SOCS1對抑癌基因p53的正向調節作用，是HBV相關性肝癌發展的一個重要機制。

事實上，多種類型腫瘤中常存在SOCS基因啟動子區甲基化，使得SOCS1和SOCS3表達降低，JAK2-STAT信號通路異化，最終導致腫瘤細胞的無限增殖[19]。Aniagu等[20]認為在肝癌發生、發展過程中 SOCS1甲基化呈動態變化：初期階段甲基化主要發生在 SOCS1基因啟動子區域的組蛋白水平；隨著癌癥進一步發生，甲基化則逐漸蔓延至基因啟動子的CpG島。Lena等[21]通過將腺病毒轉染miR-203進入小鼠角阮細胞中之后，SOCS3的表達水平有小幅度上升，認為SOCS3有可能是miR-203的靶基因，但并不一定是直接靶基因。因此，有關miR-203與SOCS1、SOCS3的關系有待于進一步研究證實。本研究發現肝癌患者的miR-203a-3p和SOCS1、SOCS3表達水平均有所下調，SOCS1和SOCS3的甲基化水平則呈上升趨勢，同時miR-203a-3p和SOCS1、SOCS3的表達水平在肝癌患者中呈正相關關系，與SOCS1和SOCS3的甲基化水平呈負相關關系，說明兩者可能共同參與了肝癌的發生與發展。

綜上所述，miR-203a-3p可能對原發性肝癌的SOCS1、SOCS3甲基化修飾有影響，有望為其臨床診治提供新靶點。miRs調控靶基因的機制復雜，miR-203a-3p和SOCS1、SOCS3的具體關系及其具體機制還需要進一步研究證實。