阿爾茨海默病患者外周血microRNA-146a、Aβ1-42蛋白、tau蛋白的表達(dá)及臨床意義①

黃 攀 徐 敏 何曉英 易興陽

(德陽市人民醫(yī)院，德陽 618000)

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一種發(fā)生在老年期或者老年前期的慢性中樞神經(jīng)退行性疾病，主要以進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙、記憶力下降、日常生活能力下降、精神行為異常為主要臨床表現(xiàn)[1]。據(jù)估算，我國現(xiàn)有AD患者600萬～800萬，面對(duì)如此龐大的患病群體，AD治療的選擇方案極少，究其原因是由于AD的發(fā)病機(jī)制尚不完全明確[2,3]，而隨著家族性AD的發(fā)現(xiàn)，基因?qū)W說參與AD的致病逐漸受到人們的關(guān)注。microRNA是一類長17～23個(gè)核苷酸長度的非編碼小分子物質(zhì)，廣泛參與機(jī)體生長、發(fā)育以及疾病發(fā)生發(fā)展的調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)microRNA-146a在術(shù)后認(rèn)知功能障礙、孤獨(dú)癥等疾病中存在著差異表達(dá)譜，并且與這些疾病的發(fā)生密切相關(guān)[4-6]。為了解microRNA-146a在AD患者中是否也存在著差異表達(dá)以及在AD的發(fā)病中發(fā)揮著何種機(jī)制，特設(shè)計(jì)此研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1臨床資料 選取我院2015年7月至2018年7月住院治療的AD患者98例作為試驗(yàn)組(experiment group,exp group)，其中男性54例，女性44例，年齡66～81歲，平均(67.18±6.53)歲。另選取健康者50例作為對(duì)照組(control group)，其中男性26例，女性24例，年齡65～80歲，平均(68.74±6.62)歲。試驗(yàn)組納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《精神障礙診斷與統(tǒng)計(jì)手冊(cè)》[7]中有關(guān)于阿爾茨海默病的疾病診斷標(biāo)準(zhǔn)的患者；②年齡>60歲的患者；③簡易智能精神狀態(tài)量表(mini-mentai state examination，MMSE)評(píng)分提示存在認(rèn)知功能障礙的患者，即文盲患者M(jìn)MSE≤17分，小學(xué)患者≤20分，中學(xué)及以上文化程度患者≤24分；④能完成本研究的患者；⑤頭顱CT或MRI、臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室檢查提示無腦出血、腦梗死、顱內(nèi)占位的患者。試驗(yàn)組排除標(biāo)準(zhǔn)：①其他類型癡呆患者如血管性癡呆、晚期帕金森病患者、顱內(nèi)感染患者、精神分裂癥、抑郁癥患者；②伴有嚴(yán)重的心、肝、肺、腎功能不全患者；③明顯衰竭患者；④已使用過治療癡呆藥物；⑤MMSE評(píng)分大于24分的AD患者。對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)：無中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、無癡呆的非神經(jīng)系統(tǒng)疾病者、無嚴(yán)重心肝腎肺疾病。本研究通過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者或法定授權(quán)人簽署知情同意書。兩組在年齡、性別等一般資料方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.1.2儀器 離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠，TGL-16c)，Trizol試劑盒(InvitroggenTM，15596-026)，核酸蛋白測定儀(上海琪特，WXJ-9388),PCR擴(kuò)增儀(杭州博日科技，TC-XP)。

1.2方法

1.2.1樣本采集 清晨抽取所有納入者空腹外周靜脈血樣本5 ml，放置于室溫下自然凝固15 min，然后將凝固的血液樣本在3 000 r/min的離心機(jī)中離心30 min，離心后仔細(xì)分離收集上層血清并儲(chǔ)存在-80℃超低溫冰箱，用于血清總RNA 的提取及RT-PCR、ELISA、Aβ1-42蛋白、tau蛋白的檢測。

1.2.2RT-PCR檢測 按照Trizol試劑盒提取血清總RNA后以核酸蛋白測定儀測定的OD260/OD280的值在1.8～2.0視為合格RNA，然后采用M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒合成cDNA(InvitrogenTM,C-28025)，第一鏈cDNA合成后將RT-PCR反應(yīng)混合液置于PCR擴(kuò)增儀的96孔反應(yīng)板中，2×PCR Mix 5.0 μl，引物工作液(2.5 μmol/L)1.0 μl，Template 1.0 μl，ddH2O 2.8 μl，Rox0.2 μl，總體積10 μl，每個(gè)樣本均做3復(fù)孔，擴(kuò)增循環(huán)條件:95℃，1 min;95℃、15 s，58℃、20 s，72℃、45 s，共 40 個(gè)循環(huán)。microRNA-146a引物序列為:Forward:5′-CCTGAGAAGTGAATTCCATGGG-3′；reverse:5′-CTCAACTGGTGTCGTGG-AGTC-3′；內(nèi)參基因U6引物序列為：Forward:5′-CTCGCTTCGGCAGCACAT-3′；reverse:5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。因RT-PCR中Ct值不能作為原始數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，本研究采用2-ΔΔCt代表microRNA的相對(duì)表達(dá)量。ΔCt=(目標(biāo)microRNA Ct值-內(nèi)參基因U6 Ct值)。

1.2.3Aβ1-42蛋白、tau蛋白濃度檢測 采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定兩組患者外周血清中Aβ1-42蛋白、tau蛋白濃度，試劑盒由武漢拜意爾生物科技有限公司提供，酶標(biāo)儀由北京普朗新技術(shù)有限公司，型號(hào)DNM-9602。嚴(yán)格按照說明書步驟建立標(biāo)準(zhǔn)曲線后根據(jù)各孔的吸光度計(jì)算Aβ1-42蛋白、tau蛋白濃度。

2 結(jié)果

2.1兩組基線資料比較 兩組患者基線資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示二者具有可比性(P>0.05)。見表1。

2.2microRNA-146a在人類基因組中位置及保守性分析 采用加州大學(xué)圣克魯斯分校研制的UCSC基因組在線工具(http://genome-asia.ucsc.edu)對(duì)microRNA-146a在人類基因組中的位置及保守性分析發(fā)現(xiàn)，microRNA-146a定位于5q33.3人染色體上160485325-160485450位置，長度為99 bp，并且其核苷酸序列在人、恒河猴、小鼠、狗、大象、雞6個(gè)物種中高度保守。見圖1。

2.3兩組患者外周血清microRNA-146a、Aβ1-42、tau蛋白比較 試驗(yàn)組患者外周血清中microRNA-146a的相對(duì)表達(dá)量明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而試驗(yàn)組患者外周血清中Aβ1-42濃度明顯低于對(duì)照組，tau濃度高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

圖1 microRNA-146a在人類基因組中的位置及保守性分析Fig.1 Location and conservation of microRNA-146a in human genome

表1 兩組患者基線資料比較

Tab.1 Comparison of baseline data between two groups

ItemExp group(n=98)Control group(n=50)t/χ2PSex(Male/Female)54/4426/240.120.72Age(year)67.18±6.5368.74±6.621.360.17BMI(kg/m2)22.87±3.2323.65±3.411.340.18Hypertension[n(%)]33(33.67%)14(28.00%)0.490.48 Diabetes[n(%)]18(18.36%)6(12.00%)0.980.32TG(mmol/L)1.42±0.211.46±0.220.590.55TC(mmol/L)4.17±0.854.10±0.920.520.60HDL-C(mmol/L)0.93±0.350.84±0.321.550.12LDL-C(mmol/L)2.71±0.852.92±0.911.490.14

表2 兩組患者外周血清microRNA-146a、Aβ1-42、tau蛋白比較

Tab.2 Comparison of microRNA-146a,Aβ1-42,tau protein between two groups

ItemExp groupControl grouptPmicroRNA-146a2.45±0.430.98±0.1231.520.00Aβ1-42(pg/ml)37.43±6.7551.26±9.249.380.00tau(pg/ml)22.87±4.5113.64±2.9115.030.00

2.4microRNA-146a與Aβ1-42、tau蛋白相關(guān)性分析 試驗(yàn)組患者外周血microRNA-146a與Aβ1-42蛋白呈負(fù)相關(guān)性(r=-0.882，P=0.000)，與tau蛋白無相關(guān)性(r=0.129，P=0.205)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 microNRA-146a與Aβ1-42、tau蛋白相關(guān)性分析Fig.2 Correlation analysis between microNRA-146a and Aβ1-42,tau protein

3 討論

AD的組織病理學(xué)改變?yōu)樯窠?jīng)炎性斑(嗜銀神經(jīng)軸索突起包繞Aβ而形成)、神經(jīng)原纖維纏結(jié)(由過度磷酸化的微管tau蛋白于神經(jīng)元內(nèi)高度螺旋化形成)以及神經(jīng)元缺失和膠質(zhì)增生[8]。在機(jī)體中β水解酶和γ水解酶通過水解淀粉樣前體蛋白形成Aβ1-40和Aβ1-42蛋白，研究顯示單體的Aβ蛋白并無神經(jīng)毒性，而當(dāng)單體水解后產(chǎn)生可溶性Aβ聚集體才是導(dǎo)致AD發(fā)病的關(guān)鍵因素[9]。Aβ寡聚體可與中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的多種受體識(shí)別結(jié)合，引起神經(jīng)元細(xì)胞鈣超載、小膠質(zhì)細(xì)胞膜電位下降、谷氨酸水平升高進(jìn)而導(dǎo)致AD的發(fā)生[10]。雖然機(jī)體內(nèi)Aβ1-42的表達(dá)量遠(yuǎn)不及Aβ1-40，但Aβ1-42的神經(jīng)毒性卻遠(yuǎn)強(qiáng)于Aβ1-40且更容易形成淀粉樣蛋白從而導(dǎo)致神經(jīng)炎性斑的形成[11]。tau蛋白分布于神經(jīng)元內(nèi)，與微管蛋白結(jié)合后形成微管，這種復(fù)合物對(duì)于維持神經(jīng)細(xì)胞的軸突運(yùn)輸以及細(xì)胞骨架的穩(wěn)定性具有重要作用[12]。tau蛋白分子結(jié)構(gòu)上具有很多磷酸化位點(diǎn)，病理狀態(tài)下tau蛋白被過度磷酸化，這種過度磷酸化的tau蛋白不再具有結(jié)合微觀蛋白的能力，反而具有促進(jìn)tau蛋白相互聚合纏繞形成神經(jīng)元纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles,NFTs)[13]，tau蛋白的聚合被認(rèn)為是AD形成的基礎(chǔ)[14,15]。既往對(duì)于Aβ1-42蛋白及tau蛋白的研究主要集中于腦脊液中，然而腦脊液獲取標(biāo)本較難，外周血取材方便，積極探索外周血中Aβ1-42蛋白及tau蛋白對(duì)于AD的診斷具有重要意義，然而由于血腦屏障的存在且外周血容量較大，相關(guān)蛋白濃度被大大稀釋，因此必須采用靈敏度高的檢測手段。酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)相對(duì)于其他檢測方法靈敏度大大提高，其原理為酶是一種有機(jī)催化劑，極少量的酶即可誘導(dǎo)大量的催化反應(yīng) ，產(chǎn)生可供觀察的顯色反應(yīng)現(xiàn)象，因此該體系常被稱為酶放大體系，其精確程度達(dá)到可以在細(xì)胞或亞細(xì)胞水平上示蹤抗原或抗體的所在部位，甚至在微克、甚至納克水平上對(duì)其進(jìn)行定量[16]。在本研究中運(yùn)用ELISA技術(shù)對(duì)試驗(yàn)組與對(duì)照組患者外周血清中的Aβ1-42蛋白濃度及tau蛋白濃度進(jìn)行定量檢測，結(jié)果顯示AD患者外周血清中Aβ1-42蛋白濃度明顯低于對(duì)照組，提示AD患者外周血Aβ1-42蛋白水平可以作為AD潛在的生物學(xué)標(biāo)志物。目前關(guān)于AD患者外周血Aβ1-42蛋白表達(dá)趨勢尚未統(tǒng)一，部分文獻(xiàn)與本文結(jié)果不一致，經(jīng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)推測可能有以下幾種原因：①AD發(fā)生時(shí)，腦脊液中大量的Aβ1-42蛋白在腦內(nèi)纏繞形成神經(jīng)元炎性斑，進(jìn)而導(dǎo)致分泌外周血中的Aβ1-42蛋白減少；②外周血中Aβ1-42蛋白還可由血小板及骨骼肌分泌，其代謝受到肝腎功能的影響；③Aβ1-42蛋白分子結(jié)構(gòu)決定其疏水活性，與外周血中的脂蛋白、清蛋白結(jié)合使得其檢測結(jié)果也會(huì)受到影響。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)AD患者tau蛋白濃度明顯高于對(duì)照組，與其他研究結(jié)論類似，目前認(rèn)為腦脊液中tau蛋白濃度可以較好地識(shí)別AD患者穩(wěn)定期與進(jìn)展期，而外周血tau蛋白則可以區(qū)分AD患者與認(rèn)知功能正常者[17]。

microRNA是一類可調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)轉(zhuǎn)錄的小分子RNA，廣泛參與疾病發(fā)生、發(fā)展的調(diào)控，其在外周血中表達(dá)穩(wěn)定，可被穩(wěn)定的檢測，已成為多種疾病的生物學(xué)標(biāo)志物[18]。microRNA功能多樣，同一種microRNA在不同物種之間可能表達(dá)不同，也具有不同的功能[19]。microRNA-146a是眾多RNA分子家族成員中的一員，為進(jìn)一步探究AD患者外周血清中microRNA-146a的表達(dá)譜，本研究先通過生物信息學(xué)方法顯示microRNA-146a在人體中具有高度保守性，這為設(shè)計(jì)microRNA-146a引物序列以及后續(xù)試驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)，而RT-PCR檢測結(jié)果也表明AD患者外周血清中microRNA-146a相對(duì)表達(dá)水平高于對(duì)照組，提示microRNA-146a可以與AD的發(fā)病有關(guān)。為進(jìn)一步探討其在AD中的可能機(jī)制，本研究采用相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)microRNA-146a與Aβ1-42蛋白存在負(fù)相關(guān)性，而與tau蛋白無相關(guān)性。中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥也是引起AD的原因之一[20]，其中重要的機(jī)制便是AD患者腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)分泌的炎癥因子可以降低降解Aβ蛋白的關(guān)鍵酶-胰島素降解酶，導(dǎo)致Aβ清除減少而沉積于腦內(nèi)形成炎性斑塊[21,22]，而研究發(fā)現(xiàn)microRNA-146a可以通過多種途徑參與炎癥反應(yīng)，起到抑制炎癥的作用，包括負(fù)性調(diào)節(jié)重要的炎癥信號(hào)通路TLR通路、MAPK信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路[23-26]等，提示在AD患者中microRNA-146a的表達(dá)升高可能通過負(fù)性調(diào)控炎癥反應(yīng)進(jìn)而參與Aβ1-42蛋白的清除。此外，研究也發(fā)現(xiàn)炎癥反應(yīng)不僅可以影響tau蛋白的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后修飾，還進(jìn)而以影響寡聚tau蛋白的傳播進(jìn)而參與AD的發(fā)病[27,28]，但本研究并未發(fā)現(xiàn)microRNA-146a與tau蛋白的相關(guān)性，推測炎癥雖然參與AD的發(fā)病，但在AD患者microRNA-146a并未通過調(diào)控影響tau蛋白代謝的炎癥反應(yīng)，其具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述，AD患者外周血清中存在microRNA-146a、Aβ1-42蛋白、tau蛋白的差異表達(dá)，且microRNA-146a在AD的發(fā)病中可能是通過調(diào)控Aβ1-42蛋白而不是tau蛋白，microRNA-146a可能是潛在治療AD的靶點(diǎn)。然而，本研究樣本量較小、單中心研究、僅進(jìn)行了相關(guān)性分析，未對(duì)其機(jī)制進(jìn)入研究，其結(jié)論尚需更多的研究補(bǔ)充驗(yàn)證。