高遷移率族蛋白B1翻譯后修飾與疾病①

劉蔚婷 石詠軍 曹師榮

(惠州市中心人民醫院,惠州 516001)

高遷移率族蛋白B1(high mobility group box 1 protein，HMGB1)是細胞核內一種含量豐富的DNA結合非組蛋白，因其在聚丙烯酰胺凝膠電泳時的快速遷移而得名。生理狀態下，HMGB1在細胞核內參與DNA復制、轉錄、翻譯，在細胞應激過程中，它經翻譯后修飾(post-translational modifications，PTMs)，在細胞質中及細胞外以一種“晚期炎癥介質”和“損傷相關模式分子”的新角色與不同受體結合，從而介導疾病的炎癥發展及免疫應答。HMGB1不同亞型也在腫瘤的發生、浸潤和轉移的生物學行為中發揮不同作用。本文就HMGB1的PTMs在一些炎癥、免疫及腫瘤疾病中的研究進展進行綜述。

1 HMGB1及其翻譯后修飾

1.1HMGB1的結構及功能 HMGB1是哺乳動物中表達最豐富和分布最普遍的核蛋白，其氨基酸序列同源性>98.5%[1]。人類HMGB1含有215個氨基酸殘基，主要由A-box、B-box和C-tail 3個結構域組成。A-box和B-box為DNA結合域，而C-tail可增加A-box和B-box與DNA的親和力。此外，HMGB1含有核定位序列(nuclear localization sequences，NLSs)和核輸出序列(nuclear export sequences，NESs)，它們分別為核輸入蛋白復合物和核輸出蛋白復合物所識別。這些均是HMGB1能在細胞核和細胞質不斷穿梭和發揮不同生物學作用的結構基礎。生理狀態下，細胞核內HMGB1的A、B-box通過結合和彎曲DNA結構共同參與DNA復制和穩定染色質結構，從而調節基因轉錄、重組以及促進DNA損傷修復等。在感染、細胞應激、免疫反應等情況下，HMGB1發生翻譯后修飾，主要發生在A-box(含NLS1序列)和NLS2等結構上(圖1)[2]，隨后HMGB1呈現出核轉運，并主動釋放到細胞外，參與炎癥的發生或反饋性調節程序性細胞死亡。

圖1 HMGB1的結構及其翻譯后修飾Fig.1 Structure of HMGB1 and its post-translatio-nal modifications

1.2HMGB1翻譯后修飾的形式和功能 HMGB1有數種PTM形式，包括乙酰化、ADP-核糖基化、甲基化、磷酸化、糖基化和氧化(完全還原化、部分氧化、完全氧化)等。PTMs對HMGB1的亞細胞定位和生物學功能至關重要。不同的HMGB1亞型發揮不同的生物學活性。生理狀態下，NLSs位點完全還原化使HMGB1主要定位在細胞核，使其參與染色質穩定以及DNA復制等基本生命活動過程。而HMGB1在NLSs位點上的乙酰化、甲基化和磷酸化均能促進其從胞核到胞質的易位并影響其生物學功能。在程序性細胞死亡(包括焦亡、壞死、凋亡、中性粒細胞胞外誘捕網等)或分泌溶酶體的介導下，細胞質中的HMGB1釋放或分泌到細胞外。而HMGB1的氧化修飾決定了它在細胞外調節炎癥和細胞死亡方式的能力，對激活炎癥小體和細胞焦亡、促進自噬、對抗細胞凋亡等活動有著重要影響[2-6]。本文重點敘述HMGB1的乙酰化、甲基化、磷酸化和氧化修飾。

乙酰化：HMGB1乙酰化可發生在NLS的賴氨酸位點2(lysine，Lys2)和Lys11上。HMGB1的NLSs位點乙酰化是目前研究最多的調控HMGB1從胞核轉向胞質的PTM[3]。脂多糖或干擾素等刺激因子通過JAK/STAT1信號通路誘導HMGB1的NLSs位點乙酰化，從而促進核HMGB1向細胞質易位[3]。乙酰化HMGB1可能通過與NLRP3受體結合，活化IL-1β和IL-18 等炎癥因子，參與觸發細胞焦亡，促進炎癥發生[4,5]。

甲基化：髓細胞終末分化的過程中,中性粒細胞中的HMGB1在Lys42上發生單甲基化[7]。甲基化修飾通過改變A-box的構象，顯著降低HMGB1的DNA結合活性,使HMGB1從中性粒細胞核轉移到細胞質并成為抗中性粒細胞胞漿抗體(ANCA)的新抗原[7]。

磷酸化：在脊椎動物中，HMGB1磷酸化由PKC、酪蛋白激酶Ⅰ等介導[8]。磷酸化對HMGB1結合和彎曲DNA的親和力、核質分布和釋放均有影響[8-10]。TNF-α通過依賴鈣調蛋白依賴激酶IV的鈣信號通路可使巨噬細胞中HMGB1的NLSs上多個絲氨酸殘基(35、39、42、46、53和181)發生磷酸化，這降低了HMGB1與核輸入蛋白復合物的結合力，從而促進其向細胞質轉移及其最終的釋放[10-12]。磷酸化HMGB1作為致炎因子參與一些炎癥和免疫疾病過程，如缺血再灌注損傷[13]。

氧化：細胞外HMGB1的氧化修飾發生在它的三個關鍵半胱氨酸殘基(cysteine，Cys)上，即Cys23、Cys45和Cys106位點。Cys23、Cys45和Cys106位點的氧化還原程度影響了HMGB1在細胞外調節炎癥的能力：完全還原化HMGB1(SH-SH-SH)在Cys23、Cys45、Cys106 位點均連接硫醇側鏈，它與趨化因子CXCL12形成復合物，通過趨化因子受體4(C-X-C chemokine receptor type 4，CXCR4)通路發揮趨化作用[14]。部分氧化HMGB1在Cys23和Cys45之間形成二硫橋，因此又稱二硫化HMGB1(S-S-SH)，作為一個強力促炎因子通過Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)通路引發炎癥反應[15-17]。完全氧化HMGB1的Cys23、Cys45、Cys106位點全被氧化，又稱磺化HMGB1(R-SO3H)，它處于一種免疫惰性狀態，不與CXCR4或TLR4結合，既無趨化活性也無促炎活性。由此可見，完全還原化和二硫化HMGB1有促進炎癥發生的功能，而磺化HMGB1則可能起著抑制炎癥發生的作用。

HMGB1的各種翻譯后修飾既可獨自發揮作用又有相互聯系。如乙酰化、甲基化、磷酸化等修飾通過不同的信號通路各自促進HMGB1從細胞核轉移到細胞外。氧化修飾中，具有趨化活性的完全還原化HMGB1和具有促炎活性的二硫化HMGB1相互協同促進炎癥的發生發展，而不具免疫活性的磺化HMGB1則對完全還原化、二硫化HMGB1起拮抗作用[18]。

2 HMGB1翻譯后修飾與疾病的關系

2.1HMGB1翻譯后修飾與炎癥

2.1.1膿毒癥 膿毒癥發生時,巨噬細胞、中性粒細胞等免疫細胞中HMGB1的NLSs位點廣泛乙酰化，使得HMGB1向細胞質移動并進一步被特異性分泌溶酶體包裹，隨后乙酰化HMGB1即以胞吐的方式主動釋放到胞外[19]。細胞外乙酰化HMGB1反過來刺激巨噬細胞、中性粒細胞的遷移和吞噬[20]，并激活一系列促炎細胞因子的產生和分泌，如TNF、IL-1、IL-6、IL-8，進而發揮炎癥介質效應[4]。

另有研究表明，給予急性期膿毒癥存活者抗HMGB1單克隆抗體對學習和記憶能力有顯著的保護作用，而給予二硫化HMGB1可誘導認知障礙[21]。雖然二硫化HMGB1導致認知功能障礙的機制尚不明確，但這些結果已經提示二硫化HMGB1對發生認知功能衰退的膿毒癥后遺癥患者有神經性炎癥致病作用，為在臨床上應用HMGB1單克隆抗體以改善疾病預后提供了重要的實驗依據。

2.1.2創傷 有研究證實，二硫化HMGB1是參與創傷后全身炎癥的重要介質。重度創傷患者在創傷后3～6 h表達了第二個全身性HMGB1波峰，其中的二硫化HMGB1與全身炎癥嚴重程度顯著相關。這些結果為進一步探索二硫化HMGB1在創傷后炎癥反應中的作用機制提供了實驗基礎，并為抑制二硫化HMGB1釋放提供了時間窗[22]。

2.1.3藥物性肝損傷 HMGB1與對乙酰氨基酚(acetaminophen，APAP)中毒的發生機制有密切關系，HMGB1參與APAP所致的急性肝損傷在人類和動物模型中都有廣泛研究[23,24]。Daniel等[23]為了解HMGB1的PTMs對APAP肝毒性的影響，首次在臨床研究中對活化免疫細胞產生的血液循環乙酰化HMGB1進行了定性和定量分析。結果發現相比肝損傷患者血清總HMGB1的變化，血清乙酰化HMGB1僅在肝衰竭等預后差或死亡的患者中才升高。這表明，血乙酰化HMGB1的水平可能反映了肝炎癥細胞浸潤和活化的程度，而且比HMGB1更具有提示預后不良的特異性。

2.1.4缺血再灌注損傷 最近研究表明，HMGB1作為一種損傷相關模式分子，可在心臟、肝臟、腎臟、大腦等多個器官中引發缺血再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷的炎癥反應[13,25-27]。Tsung等[13]研究表明，細胞外的乙酰化、磷酸化和甲基化HMGB1可能通過刺激TNF和IL-6的生成觸發肝臟I/R損傷的炎癥反應。Liu等[28]研究卻發現HMGB1的氧化修飾減弱了其在肝損傷過程的促炎活性，但該研究并未指出是HMGB1的部分氧化亦是完全氧化減弱了其促炎活性。而肝I/R損傷是一個以促炎活動為主的過程，是否乙酰化、磷酸化和甲基化HMGB1的促進炎癥作用超越了氧化HMGB1的抑制炎癥作用，尚待進一步研究。Yang等[29]研究提出β-石竹烯可通過抑制 HMGB1/ccTLR4/NK-κB通路減輕小鼠局灶性腦缺血再灌注損傷，而二硫化HMGB1正是通過TLR4通路發揮促炎活性的。β-石竹烯是否通過抑制二硫化HMGB1減輕缺血再灌注損傷尚有待進一步研究。

2.1.5癲癇 HMGB1是致癇性損傷引起的無菌性神經炎的已知介質。Walker等[30]發現，在急性致癇性損傷動物模型的腦海馬組織裂解物中，乙酰化HMGB1在癲癇持續狀態后3 h至4 d內逐漸增加。HMGB1的氧化還原狀態在癲癇形成過程中也發生了變化：在癲癇持續狀態后第3小時，僅檢測出完全還原化HMGB1的增加，但在6 h至4 d內，二硫化HMGB1也隨完全還原化HMGB1一起增加，而磺化HMGB1在癲癇持續狀態后的任何時間點均未檢測到。在同一實驗動物模型的血液中，乙酰化和二硫化HMGB1增加相對腦組織延遲了6小時以上，并且二硫化HMGB1也出現在完全還原化HMGB1增加之后。這些實驗結果反映了在癲癇形成過程中HMGB1可能由腦脊液向血液轉運，并且不同時間段的乙酰化和二硫化HMGB1的水平可能反映了致癇性損傷后細胞損傷的程度。

目前癲癇診斷后發作和復發的預后評估是基于年齡、發作類型、腦電圖和磁共振成像等臨床因素，但這缺乏精確性，聯合檢測腦脊液或血液中乙酰化和二硫化HMGB1的水平變化或許能使現有評估標準得到可觀的改進。

2.2HMGB1翻譯后修飾與自身免疫性疾病

2.2.1類風濕性關節炎 對幼年型類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis，RA)患者關節滑液的質譜分析表明[31]，滑膜巨噬細胞、成纖維細胞和血管內皮細胞在滑膜組織中分泌了大量乙酰化HMGB1，以及有趨化作用和炎癥因子誘導功能的完全還原化和二硫化HMGB1，而中性粒細胞在滑膜組織中釋放的主要是單甲基化HMGB1，它們可能通過促進TNF、IL-1等炎癥因子的產生而共同參與滑膜炎的發生。

2.2.2系統性紅斑狼瘡 系統性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)患者血漿中HMGB1水平升高并與疾病活動相關。磺化HMGB1喪失刺激細胞因子或誘導趨化的功能，相反它可誘導免疫耐受，雖然這與SLE以凋亡為中心的細胞死亡形式相符，卻不符合SLE免疫性炎癥的特點[32，33]。上述結論提示，除凋亡外，SLE的免疫性炎癥過程還可能通過細胞焦亡或中性粒細胞胞外誘捕網等程序性細胞死亡方式導致細胞死亡，而這可能由具有免疫活性的完全還原化和二硫化HMGB1介導。然而，目前關于HMGB1亞型與SLE發病機制關系的研究甚少，這是值得我們進一步探索的問題。

2.2.3系統性硬化癥 系統性硬化癥(systemic sclerosis,SSc)典型病理過程是中性粒細胞介導的血管內皮細胞的激活和損傷。Norma等[34]研究發現，HMGB1氧化修飾影響著中性粒細胞的激活程度：中性粒細胞胞膜上髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)的表達水平可反映其活化程度。而磺化HMGB1在誘導膜MPO表達上明顯優于完全還原化HMGB1。這提示磺化HMGB1參與SSc的發病過程。

2.3HMGB1翻譯后修飾與腫瘤 HMGB1在腫瘤發生發展中是一把雙刃劍，起著致癌和抑癌的雙重作用，這與HMGB1的定位和PTMs有著密切聯系[35]。

2.3.1致癌作用 細胞外HMGB1通過多種受體，如晚期糖基化終產物受體(receptor of advanced glycation end product,RAGE)和TLR4，介導腫瘤微環境中細胞的相互作用，促進癌細胞的生長和擴散，包括維持炎癥微環境[36-38]，補充代謝需要[35，39]，促進侵襲和轉移[40]，抑制抗癌免疫[41]，促進血管生成[42,43]。二硫化HMGB1通過與RAGE結合誘導自噬，促進癌細胞的抗藥性，從而促進癌癥的發展[44]。

2.3.2抑癌作用 細胞核內HMGB1具有DNA伴侶活性的重要結構因子，HMGB1的缺失將導致基因組不穩定，端粒縮短。另外，HMGB1的缺失還會導致炎癥和細胞器損傷，而這恰是癌癥發生的主要驅動力[39,45]。與二硫化HMGB1相反，活性氧簇作用形成的磺化HMGB1增加了抗癌藥物的細胞毒性，并通過線粒體途徑誘導細胞凋亡，從而抑制癌癥的發展[46]。這提示，阻斷二硫化HMGB1釋放和促進HMGB1的磺化可能對治療癌癥有幫助。

3 問題與展望

在生物學領域，HMGB1是罕見的具有豐富結構形式和功能的分子。HMGB1以其復雜多樣的PTMs形成的不同亞型參與多種疾病的發生發展，它在癌癥中的雙相作用更是展現出其獨特的生物學效應。然而HMGB1的PTMs在多大程度上影響著疾病的發生發展和預后，及其形成的不同亞型作為生物標志物的優勢和局限性有待更進一步的研究。探索HMGB1亞型的功能多樣性一直是醫學研究的熱點，也是開發新的抗炎和免疫抑制療法的關鍵。