檳榔不同炮制品對斑馬魚急性毒性比較研究

林青華，屈文佳，秦華珍，賈 哲，徐新房，李向日，3*

(1.廣西中醫藥大學 藥學院，廣西 南寧 530200；2.北京中醫藥大學 中藥學院，北京 102488；3.北京中醫藥大學 中藥品質評價北京市重點實驗室，北京102488；4.廣西中醫藥大學廣西壯瑤藥工程技術研究中心，廣西 南寧 530200)

檳榔是棕櫚科植物檳榔(ArecacatechuL.)的干燥成熟種子，其味苦、辛，性溫，歸胃、大腸經，具有殺蟲、消積、行氣、利水、截瘧之功，用于絳蟲病、蛔蟲病、姜片蟲病、蟲積腹痛、里急后重、積滯泄痢、水腫腳氣、瘧疾的治療[1]。檳榔常被炮制成生檳榔、炒檳榔或焦檳榔而用于臨床。現代研究表明檳榔含有生物堿類、鞣質類、油脂類、黃酮類、三萜類和甾體類等多種化學成分，具有驅蟲、助消化、抗氧化、抗抑郁等多種藥理活性[2-3]。近年來，檳榔的毒理學研究結果表明其具有口腔毒性、肝毒性、心臟毒性、腎毒性等多種毒性反應[4-6]，但具體毒性成分仍未完全明確，且檳榔炮制品的毒性研究鮮有報道。因此，本文采用斑馬魚為試驗對象，對生檳榔、炒檳榔和焦檳榔的急性毒性進行研究，以期為檳榔毒性成分的篩選提供參考。

1 材料與儀器

1.1 藥材

生檳榔購于北京同仁堂藥材有限責任公司，經北京中醫藥大學李向日教授鑒定為棕櫚科植物檳榔ArecacatechuL.成熟種子的炮制品；炒檳榔、焦檳榔為本實驗室依照《中國藥典》(2015年版)規定而炒制的合格炮制品。樣品留樣存放于北京中醫藥大學中藥學院炮制教研室。

1.2 動物

AB型斑馬魚幼魚(受精卵正常發育4天)由北京中醫藥大學中藥學院提供，斑馬魚親本購于中國科學院武漢水生生物研究所。

1.3 儀器與試劑

斑馬魚循環水養殖系統(北京愛生科技公司)；LRH-250 Z型恒溫生化培養箱(廣州滬瑞明儀器有限公司)；島津LC-20 A高效液相色譜儀(LC-20 AD泵，SPD-20 A檢測器，Lcsolution處理軟件，島津公司)；Ultimater ?XB-SCX色譜柱(4.6 mm× 250 mm，5 μm，月旭科技)；紫外-可見分光光度儀(北京普析通用儀器有限公司)；FA-1004電子分析天平(上海天平儀器廠)；SB 25-12 DTDN型數控超聲波清洗器(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

沒食子酸對照品(天津市光復精細化工研究所，批號20121107，純度99.0%)；檳榔堿氫溴酸鹽(批號1391，純度>98.0%)購于上海施丹德生物技術有限公司，去甲基檳榔堿氫溴酸鹽(批號Q-075-170930，純度>98.0%)；檳榔次堿鹽酸鹽(批號B-084-170928，純度>98.0%)購于成都瑞芬思生物科技有限公司；去甲基檳榔次堿鹽酸鹽(批號JS20171103，純度>98.0%)購于湖北巨勝科技有限公司；乙腈(色譜純，Fisher公司)；氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、碳酸氫鈉、氯化鈣、鹽酸、溴水、磷酸、氨水(北京化工廠)，碳酸鈉、鎢酸鈉、硫酸鋰(天津福晨化學試劑廠)，鉬酸鈉(天津市化學試劑四廠)，干酪素(北京奧博星生物技術有限責任公司)，以上試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 斑馬魚的養殖與繁育

2.1.1 斑馬魚胚胎培養液配制 按照Zebrafish Book標準，分別適量稱取NaCl、KCl、Na2HPO4、K2HPO4、MgSO4、NaHCO3、CaCl2，最終配成每升含0.14 moL NaCl、5.4 moL KCl、0.25 moL Na2HPO4、0.44 moL K2HPO4、1.3 moL CaCl2、1.0 moL MgSO4和4.2 moL NaHCO3水溶液，即得斑馬魚胚胎培養液。

2.1.2 斑馬魚的養殖及繁育 斑馬魚在循環養殖系統中馴養，其水溫為(28±0.5) ℃，pH=7.0～7.2，電導率為450～550 μs/cm，每天黑暗環境(10 h)與光照環境(14 h)交替進行，以豐年蝦幼蟲喂食成年斑馬魚，每日3次。

暗周期開始前，將選取的雄性與雌性成年斑馬魚按照2∶1的比例放入產卵缸中，用隔板將其分開；暗周期結束后抽去隔板，雄魚與雌魚在光照刺激下完成交配，4 h后收集合格受精卵，將其用胚胎培養液清洗干凈后轉移到無菌培養皿中，置生化培養箱中孵育；每日上午更換胚胎培養液并及時除去死亡胚胎及胎衣，4天后選取發育正常的斑馬魚幼魚進行急性毒性研究。

2.2 試藥制備

稱取生檳榔、炒檳榔和焦檳榔粉末(過80目篩)各20 g，分別置500 mL圓底燒瓶中，加10倍量去離子水，回流提取3次，每次1 h；分別合并提取液，減壓濃縮，濃縮液水浴至流浸膏狀，60 ℃減壓干燥，分別得生檳榔、炒檳榔和焦檳榔提取物2.48 g、2.22 g和2.81 g，具體見表1。

表1 生檳榔、炒檳榔和焦檳榔水提物的制備 (n=2)

2.3 試藥中生物堿含量測定

按照本課題組確定的HPLC方法對生檳榔、炒檳榔和焦檳榔提取物中的生物堿進行含量測定。

2.3.1 色譜條件 色譜柱為Ultimate XB-SCX (250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為乙腈-磷酸鹽溶液(2 mL磷酸，2 mL氨水→1 000 mL)(72∶28)；檢測波長為215 nm；柱溫為35 ℃；進樣體積10 μL；流速為1 mL/min。

2.3.2 對照品溶液制備 精密稱取檳榔堿氫溴酸鹽、去甲基檳榔堿氫溴酸鹽、檳榔次堿鹽酸鹽和去甲基檳榔次堿鹽酸鹽6.40 mg、4.20 mg、3.37 mg和4.90 mg，分別置于10 mL容量瓶中，加流動相溶解，定容，搖勻，得各對照品母液；精密移取各對照品母液1.5 mL、2.0 mL、3.0 mL和2.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中，流動相定容至刻度，搖勻，得各對照品的單標溶液；精密移取各單標溶液1.0 mL、0.5 mL、0.5 mL、2.0 mL，置于相同的5 mL容量瓶中，加流動相定容至刻度，搖勻，過0.45 μm的微孔濾膜，取續濾液，即得對照品溶液。

2.3.3 供試品溶液制備 精密稱取生檳榔、炒檳榔和焦檳榔水提物12.7 mg、15.3 mg和14.1 mg，分別置于10 mL容量瓶中，加流動相溶解，定容，搖勻，得各供試品母液；精密移取生檳榔、炒檳榔和焦檳榔母液各2.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中，流動相定容至刻度，搖勻，分別過0.45 μm的微孔濾膜，取續濾液，得各供試品溶液。

2.3.4 供試品的測定及含量計算 采用上述HPLC方法分別對供試品和對照品進行檢測，各樣品平行檢測2次。通過外標一點法計算各供試品中生物堿的含量，具體計算公式為：檳榔堿重量=氫溴酸檳榔堿重量/1.521 4，去甲基檳榔堿重量=去甲基檳榔堿氫溴酸/1.573 2，檳榔次堿重量=鹽酸檳榔次堿/1.258 3，去甲基檳榔次堿重量=鹽酸去甲基檳榔次堿重量/1.286 7。具體結果見表2。

表2 生檳榔、炒檳榔和焦檳榔水提物中生物堿的含量 (n=2)

2.4 試藥中鞣質的含量測定

各供試品中鞣質的含量測定方法參照2015版《中國藥典》(四部)中“2202 鞣質含量測定法”項下規定內容進行檢測，具體結果見表3。

表3 生檳榔、炒檳榔和焦檳榔水提物中總鞣質的含量 (n=2)

2.5 試藥對斑馬魚的急性毒性試驗

2.5.1 供試液制備 精密稱取生檳榔、炒檳榔和焦檳榔水提物各0.200 8 g，0.200 4 g和0.200 4 g，分別加50 mL胚胎培養液，超聲溶解，制得濃度為4 000 μg/mL的生檳榔、炒檳榔和焦檳榔水提物母液，分裝，凍存，用時根據所需濃度稀釋即得供試液。

2.5.2 急性毒性研究 選取發育正常的斑馬魚幼魚置于12孔板中，每孔20條，置于培養箱中培養24 h，次日吸棄各孔培養液，加入4 mL不同濃度的各炮制品供試液，置于培養箱培養24 h，次日統計斑馬魚死亡情況并計算半數致死濃度(LC50)，每個濃度設3個復孔。結果具體見表4。

表4 生檳榔、炒檳榔和焦檳榔水提物對斑馬魚幼魚的LC50 (μg/mL)

注：采用SPSS 17.0統計軟件中的機率單位加權回歸法(Bliss法) 計算LC50。

3 討論

斑馬魚為鯉科短擔尼魚屬的一種硬骨魚，其基因與人類相似度達87%，且對藥物的反應與人的臨床反應類似，并具有個體小、繁殖量大、實驗周期短等優勢，現已成為毒理學評價中重要的模型動物[7-8]。研究表明生物堿類和鞣質類成分是檳榔的主要成分也是毒性成分[9]，且檳榔經炮制后兩者的含量會發生相應變化。因此，對生檳榔、炒檳榔和焦檳榔的急性毒性進行研究，既可以通過其LC50值比較檳榔不同炮制品的毒性大小，又可以結合其生物堿和鞣質的含量為檳榔毒性成分的初步篩選提供參考。

檳榔不同炮制品的提取結果(表1)表明，焦檳榔的提取率(14.03%)較生檳榔(12.39%)和炒檳榔(11.08%)高，這可能與焦檳榔經武火炒制后飲片堅硬度降低而利于成分溶出有關。生檳榔、炒檳榔和焦檳榔水提物中總生物堿的含量分別為3.24%、2.56%和2.07%(表2)，說明檳榔各炮制品中生物堿的總量隨著炒制溫度的升高而降低，這可能與檳榔中小分子生物堿類成分易揮發有關；而其總鞣質的含量分別為22.72%、26.68%和18.28%(表3)，說明檳榔中鞣質類成分的含量隨著炒制溫度的升高呈現先上升后下降的趨勢，與文獻報道的結果相一致[10]。

檳榔各炮制品對斑馬魚急性毒性的試驗結果表明，生檳榔、炒檳榔和焦檳榔水提物對斑馬魚的LC50值分別為29.74 μg/mL、32.47 μg/mL和40.03 μg/mL(表4)，說明生檳榔經不同的溫度炒制后毒性降低，符合中藥“炮制減毒”的基本理論。當檳榔各炮制品在LC50值時，生檳榔、炒檳榔、焦檳榔中總生物堿的含量分別為0.964 μg/mL、0.831 μg/mL和0.829 μg/mL，呈現毒性越大生物堿含量越高的趨勢，提示生物堿類成分可能是檳榔中的毒性成分，這也與文獻報道相一致[9]；而生檳榔、炒檳榔和焦檳榔總鞣質的含量分別為6.76 μg/mL、8.66 μg/mL和7.32 μg/mL，與其LC50值不呈量效關系，但文獻報道檳榔中的鞣質類成分具有毒性甚至致癌性，因此檳榔鞣質類成分的毒性仍需要進一步研究。此外，檳榔各炮制品對斑馬魚LC50值是否完全取決于生物堿、鞣質類成分的含量仍有待于研究。

綜上所述，采用斑馬魚為試驗對象對檳榔炮制品的急性毒性研究結果表明生檳榔、炒檳榔和焦檳榔水提物對斑馬魚的LC50值分別為29.74 μg/mL、32.47 μg/mL和40.03 μg/mL，符合中藥炮制減毒的基本理論，并推測生物堿類成分可能是生檳榔的毒性成分，而檳榔中鞣質類成分的毒性仍有待于進一步研究。