骨炎消對KOA家兔滑膜組織病理學形態及炎性因子表達的影響

王 琳，王寶娟，鄭曙光

(貴州中醫藥大學，貴州 貴陽 550025)

膝骨性關節炎 (Knee Osteoarthritis，KOA) 是一種以膝關節軟骨變性、缺損、軟骨下骨質及關節邊緣骨贅生成等為病理特征的慢性退行性疾病，常見于中老年人群。由于其發病機制多而復雜、病程長、易復發、不可逆性的特點，導致該疾病致殘率極高，嚴重影響患者的身心健康和生活質量[1]。膝關節滑膜炎是一種以膝關節腫痛、積液、活動不便及功能受限為主要臨床癥狀的骨傷科常見疾病，由慢性勞損或急慢性創傷造成滑膜細胞增多、血管生成和炎性細胞浸潤等病理改變，并由此而發的非感染性炎癥[2]。隨著科學的進步，針對膝骨性關節炎發病機制的研究，人們不再局限于對關節軟骨和軟骨細胞病理改變的關注上，而是逐步明確滑膜炎癥與鄰近軟骨之間的關系，以及在膝骨性關節炎發生發展的始末中所充當的重要角色。滑膜組織中分布著一些游離神經，且作用于這些游離神經中的神經因子和蛋白的高表達被認為與膝骨性關節炎癥狀的產生與變化有關[3]。研究發現，滑膜炎癥產生的促炎介質可打破軟骨基質合成與降解間的平衡，改變關節軟骨的結構，再加上過多產生的蛋白水解酶的理化作用，使膝關節的退變進程加快，反向而論，軟骨的改變也會加劇滑膜炎癥，造成惡性循環[4]。中醫針對KOA的治療，方式多樣、療效顯著，并在預防和緩解臨床癥狀、減輕患者痛苦、提高生活質量方面優于西藥，且毒副作用較小[5]。本研究通過對KOA家兔模型治療前后滑膜組織的各項指標表達的分析，探討苗醫熏蒸驗方對膝關節滑膜炎的治療效果，以及對膝骨性關節炎發展進程的延緩作用。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物

取50只體質量為(2.0±0.2)kg的成年健康新西蘭大白兔，雌雄各半，由重慶騰鑫養殖公司提供，許可證號：SCXK(渝)2017-0010，標準清潔級動物房飼養，室溫下給予復合飼料喂養。

1.2 藥物與試劑

骨炎消是由黑骨藤、透骨香、大血藤、小血藤、飛龍掌血、蜘蛛香、淫羊藿等12味藥材組成的苗藥經驗方，均購于貴州同濟堂；蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒，批號：C0105，購自碧云天生物技術有限公司；BCA蛋白定量試劑盒，批號：CW0014S，購自康為世紀生物科技有限公司；蛋白上樣Maker，批號：26625，購自Thermo生物有限公司；SDS-PAGE上樣緩沖液，批號：BL502A，購自biosharp生物科技有限公司；碘乙酸鈉，批號：305-53-3 BR，購自上海萌芽生物科技有限公司；β-Actin，批號：ab6040，購自abcom生物科技有限公司；PMSF(批號：R0010)、高效RIPA組織裂解液(批號：R0010)、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(批號：P1200-2)均購自北京索萊寶生物科技有限公司；Rabbit Anti-TNF-α(批號：bs-33207M)、Rabbit Anti-NF-κB p65(批號：bs-0465R)、Rabbit Anti-P38 MAPK(批號：bs-0637R)、Rabbit Anti-IL-1β(批號：bs-0862R)均購自北京博奧森生物有限公司。

1.3 主要儀器

切片機，型號：RM2245，德國萊卡公司；高速冷凍離心機，型號：TGL20M，長沙邁佳森儀器設備有限公司；百樂凝膠圖像分析儀，型號：ChemiDocTM Touch imaging systerm，成都百樂科技有限公司；水平電泳儀，型號：JY300，北京君意東方電泳設備有限公司。

2 方法

2.1 實驗分組

將50只體質量為(2.0±0.2)kg的成年新西蘭大白兔，雌雄各半，隨機分為正常組、模型組、陽性組、早期苗熏組和苗藥熏蒸組，每組各10只。根據王興桂等[6]前期的實驗數據顯示，將苗藥熏蒸組與清水熏蒸組進行對照治療后，其結果表明二者是具有統計學差異的，故本實驗不再增設清水熏蒸組作為對照治療。

2.2 造模方法

先用生理鹽水溶解碘乙酸鈉，且按照7.5 mg/kg的比例配置成實驗所需的不同濃度(根據家兔體重可得：將15 mg的碘乙酸鈉粉末用0.2 mL的生理鹽水溶解，所配置的碘乙酸鈉溶液為建立KOA模型實驗所需的最小濃度)。在無菌環境下把家兔置于解剖臺上，仰臥位固定，左膝關節微屈，剪掉膝關節周圍絨毛并進行消毒，用1 mL注射器由髕骨內側下方斜上刺入關節腔，注入20%烏拉坦(4 mL/kg)進行麻醉，除去正常組不做任何處理外，其余4組各注射0.2 mL碘乙酸鈉溶液，若進針后出現落空感，即為注射成功。

2.3 各組給藥方法

正常組：清潔級動物房正常飼養，不做藥物干預。模型組：造模后放置清潔級動物房正常飼養，不做藥物干預。陽性組：造模成功(關節腔注射碘乙酸鈉2周)后，膝關節上下各 4 cm范圍給予扶他林軟膏外用進行治療，每天1次，1.2 g/次，連續6周。早期苗熏組：造模后的第一天便給予苗藥熏蒸液做熏蒸治療，30 min/d，每天1次，連續8周。苗藥熏蒸組：造模成功(關節腔注射碘乙酸鈉2周)后，給予苗藥熏蒸液做熏蒸治療，30 min/d，每天1次，治療6周。

2.4 熏蒸方法

(1)首先在超聲波霧化器裝置中倒入苗藥熏蒸濃縮液，溫度調至60 ℃，將熏蒸治療時的藥液蒸汽溫度控制在35～40 ℃；(2)為利于藥液吸收，剪掉膝關節周圍的兔毛，將充分暴露膝關節后的家兔仰臥位固定在兔解剖臺上；(3)使用固定器把與超聲波霧化器相連結的軟管固定在家兔的膝關節位置，進行熏蒸治療。

2.5 組織取材及處理

無菌環境下處死家兔，在髕骨上端用手術刀橫切斷各層組織，完全暴露膝關節腔，用鑷子在髕骨下端與脛骨上端的交界處取出左后肢的滑膜組織，一部分置于4 ℃、4%的多聚甲醛中固定保存24 h，石蠟包埋、切片，常規HE染色，光鏡下觀察各組滑膜組織形態及免疫組化檢測；剩余標本分裝于5 mL離心管中，放入-80 ℃冰箱凍存備用，為后續western blot檢測做準備。

2.6 滑膜組織HE染色

將各組滑膜組織切片置二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中各10 min；100%Ⅰ、100%Ⅱ、90%、80%、70%梯度乙醇中各5 min，蒸餾水中5 min；水化后放入蘇木精中8 min，使細胞著色；自來水沖洗掉多余的蘇木精染液，滴加伊紅進行染色，2 min，水洗；95%乙醇脫水2 min、二甲苯透明5 min，各2次；中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并拍照記錄。

2.7 免疫組織化學檢測IL-1β與TNF-α的炎性表達

脫蠟：將石蠟切片放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中各10 min；水化：100%Ⅰ、100%Ⅱ、90%、80%、70%梯度乙醇中各5 min，蒸餾水中5 min；置于枸櫞酸緩沖液中抗原修復，修復過程：微波爐中高溫3 min后轉低溫20 min，自然冷卻至室溫，PBS(0.01 mol/L、 pH =7.4)漂洗20次，各3 min；滴加阻斷內源性過氧化物酶—封閉液—一抗—生物素標記山羊抗兔IGg聚合物—辣根酶標記鏈霉素卵白素工作液；DAB顯色，蒸餾水沖洗后滴加蘇木素染液進行復染；脫水、透明、封片、閱片并拍照記錄。

2.8 蛋白免疫印跡法檢測NF-κB和p38的蛋白表達

各組稱取100 mg滑膜組織放入研缽中，不斷加入液氮以保持組織脆性，將其充分研磨至粉末狀；把樣本與1 mL含1 mmol/L PMSF的蛋白裂解液充分混勻后，為使蛋白充分裂解需放置于4 ℃冰箱內靜置40 min；12 000 r/min，4 ℃低溫離心10 min，收集上清液，用BCA法測定各組樣品的蛋白濃度；SDS-PAGE技術分離蛋白，轉至PVDF膜上，配置5%脫脂奶粉封閉液50 mL，室溫搖床上封閉1 h；TBST緩沖液洗膜3次，5 min/次，然后將膜轉入自封袋中，加入一抗2 mL進行孵育，封口后放入4 ℃冰箱過夜；TBST緩沖液洗膜3次，5 min/次，加入二抗，室溫孵育2 h；再次洗膜除去二抗，滴入ECL發光液2 min后，凝膠成像系統顯影并分析條帶灰度值。

2.9 統計學分析

3 結果

3.1 光鏡下觀察各組家兔滑膜組織HE染色形態學變化

與正常組相比，模型組的滑膜細胞增多、排列緊密，組織明顯增厚，全層均有大量炎細胞浸潤和成纖維細胞增生，且有血腫與血管生成；與模型組相比，陽性組、早期苗熏組和苗藥熏蒸組的滑膜細胞排列較為疏松，組織增生程度減輕，但仍有少量的炎性細胞浸潤和血管生成。如圖1所示。

3.2 免疫組織化學檢測IL-1β與TNF-α的炎性表達

與模型組相比，正常組、陽性組、早期苗熏組和苗藥熏蒸組滑膜細胞IL-1β和TNF-α的IOD值均低于模型組，差異具有統計學意義(P<0.05)；陽性組、早期苗熏組和苗藥熏蒸組三組間滑膜細胞IL-1β和TNF-α的IOD值，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1、圖2、圖3。

組別IL-1βTNF-α正常組36.56±3.51*31.04±5.13*模型組102.97±8.6790.57±8.06陽性組49.99±3.55*46.29±5.45*早期苗熏組82.48±9.38*#76.44±9.73*#苗藥熏蒸組63.96±4.99*#58.05±6.51*#

注：與模型組相比，*P<0.05；與陽性組相比，#P>0.05。

圖1 各組滑膜組織HE染色結果(×200)

圖2 各組滑膜組織IL-1β和TNF-α免疫組化(×200)

注：與模型組相比，*P<0.05；與陽性組相比，#P>0.05

3.3 蛋白免疫印跡法檢測NF-κB和p38的蛋白表達

與模型組相比，正常組、陽性組、早期苗熏組和苗藥熏蒸組滑膜組織中NF-κB和p38的蛋白表達水平均低于模型組，差異具有統計學意義(P<0.05)；陽性組、早期苗熏組和苗藥熏蒸組3組滑膜組織中的NF-κB和p38蛋白差異無統計學意義(P>0.05)。見表2、圖4、圖5。

組別NF-κB/β-actinp38/β-actin正常組0.35±0.08*0.43±0.10*模型組1.51±0.221.45±0.03陽性組0.51±0.09*0.43±0.06*早期苗熏組0.53±0.23*#0.52±0.01*#苗藥熏蒸組0.55±0.09*#0.51±0.03*#

注：與模型組相比，*P<0.05；與陽性組相比，#P>0.05。

注：與模型組相比，*P<0.05；與陽性組相比，#P>0.05

4 討論

膝關節滑膜炎屬中醫“痹證”“傷筋”“鶴膝風”范疇，是因風、寒、濕、熱邪氣侵襲關節，加上外傷、勞損等外部誘因，造成局部氣血運行不暢、正氣虧虛，使水濕之邪乘虛而入[7]。中醫學認為，滑膜炎積液是由筋脈閉阻、濁濕流注關節所致，且關節腔內積血積液，易瘀久化熱、濕熱相持，使關節出現腫脹、皮溫升高、筋肉拘攣、屈伸不利甚至僵硬等癥狀[8]。洪素蘭認為，膝關節滑膜炎看似局部病變，實與內臟、精、氣、血、陰陽密切相關，其基本病機為“肝脾腎虧虛，痰濕瘀血阻滯”，肝脾腎虛為其本，痰濕瘀阻滯為其標[9]。所謂“不通則痛”，熏蒸療法正是從病理上治療此癥，通過皮膚滲透，從而擴張血管，促進局部血液循環，增強滑囊內液體吸收，達到消炎止痛、除濕散瘀、舒筋通絡的作用，且方法簡便易行、療效確切和無毒副作用等特點，更是體現出濃郁的苗族特色和鄉土氣息。

骨炎消為黔南、黔東南地區的民間收集驗方，由黑骨藤、透骨香、大血藤、小血藤、雞血藤、飛龍掌血、蜘蛛香、淫羊藿等12味藥組成，方中黑骨藤味苦、辛，性涼，具有很好的抗炎和鎮痛作用，且疏通筋骨、活血止痛、祛風除濕、解毒；透骨香味辛，性平，具有清熱解毒、活血祛瘀、祛風除濕、降氣平喘等作用，與蜘蛛香共用可祛風除濕、表出毒邪，使機體祛除“外毒內亂”，恢復正常的狀態，同時蜘蛛香還能理氣和中、調理脾胃，使氣血能夠得到不斷補充；飛龍掌血，味辛，微苦，性溫，歸脾、胃經，散瘀止血、祛風止痛、消腫解毒[10-11]。又因“膝者筋之府”，膝關節乃經筋會聚之所，具有連屬關節、絡綴肢體、主司關節運動的功能。當筋脈失去血液養分，筋脈不榮導致筋脈攣縮，從而導致關節活動功能發生嚴重障礙。方中大血藤、小血藤和雞血藤皆為藤本類植物，苗醫認為這類植物細長蔓延與人體的筋脈相似，可舒通筋脈、通氣散血。其中，大血藤和雞血藤又具有補血的療效，為軟骨提供必要物質，使肌肉、筋骨得以濡養，從而修復受損滑膜、增強營養補給、減少炎癥滲出、促進積液吸收，以解除關節的腫脹、僵硬、疼痛等癥狀，促進功能改善。故上述藥味合用，共奏舒筋活血、消腫止痛、舒筋通絡之功[12]。而骨碎補、狗脊、杜仲、仙靈脾均有補肝腎、強筋骨之效，為輸送基礎物質提供能量。故上述諸藥合用，條理有序、互補長短，既能調節內亂、排除毒素，又能打通筋脈、提供“氣”“血”，達到治愈疾病的目的，并且療效顯著[13]。課題組前期已經證實骨炎消在治療骨性關節炎方面具有消炎鎮痛、改善功能的作用，且苗族熏蒸療法在臨床適應癥中的免疫系統疾病、肌肉骨骼系統結締組織疾病、皮膚病的聚集度較高，尤以關節炎的治療效果較為突出[14-15]。

圖5 各組滑膜組織NF-κB和p38的蛋白表達

本實驗運用熏蒸療法對KOA家兔模型進行干預治療，通過滑膜組織相關炎性指標的檢測結果，表明骨炎消能夠改善模型組的滑膜組織形態，且降低其IL-1β、TNF-α的炎性表達和增加NF-κB、p38的蛋白表達，從而減輕滑膜組織炎癥反應，起到對膝關節的保護作用，具有很好的治療效果和推廣價值。但同時，本實驗也存在不足之處，雖然通過熏蒸方式可以降低KOA家兔滑膜組織中的炎性因子和蛋白表達水平，但具體作用在膝關節的有效治療時間和濃度還不明確，需進一步探索，且實驗過程中未對各組家兔的體重及膝關節周徑、形態、皮溫做相應的監測記錄，導致其變化無法進行組間對比；早期苗熏組與成模后進行治療的苗藥熏蒸組間無統計學差異，說明早期干預治療對膝關節滑膜炎的預防效果不明顯。