水蒸氣蒸餾-鹽析法提取金銀花揮發(fā)油工藝研究

顧 珂，王 興，胡鵬宇，李海剛，王海燕，王 雪

(臨沂大學(xué)，山東 臨沂 276000)

金銀花味甘、性寒，具有清熱解毒、涼散風(fēng)熱的功能，主治癰腫疔瘡、喉痹、丹毒、熱毒血痢、風(fēng)熱感冒、溫病發(fā)熱[1]。金銀花所含有的揮發(fā)油是其藥理活性的重要組成部分，具有清咽、解熱、化痰、平喘等功效[2]，已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化妝、香料等領(lǐng)域[3]，目前上市的中藥制劑中，金銀花露[4]及金銀花合劑系通過水蒸氣蒸餾法制得，主要為金銀花中的揮發(fā)油類成分，臨床上用于暑熱口渴，熱癤瘡毒。金銀花揮發(fā)油的提取方法主要有水蒸氣蒸餾法[5]及超臨界流體萃取法[6]，超臨界流體萃取法單次處理量較小，且對設(shè)備要求高，水蒸氣蒸餾法更為適合工業(yè)化生產(chǎn)，但是金銀花揮發(fā)油含量低，水蒸氣蒸餾過程中，部分揮發(fā)性成分溶解于水中，導(dǎo)致金銀花揮發(fā)油提取率更低，為此，本文采用鹽析法降低金銀花揮發(fā)性成分在水中的濃度，結(jié)合水蒸氣蒸餾法提取金銀花揮發(fā)油，進一步采用效應(yīng)面優(yōu)化法對水蒸氣蒸餾鹽析法提取金銀花揮發(fā)油的工藝參數(shù)進行優(yōu)化，為工業(yè)化提取金銀花揮發(fā)油提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

高速中藥粉碎機(濰坊星悅清城機械有限公司)；揮發(fā)油測定器(泰興市銘泰科教儀器設(shè)備有限公司)；數(shù)顯恒溫油浴鍋(江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠)；電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；

1.2 材料

金銀花(臨沂市平邑縣)；乙醚為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 金銀花揮發(fā)油提取流程

參照揮發(fā)油測定法甲法(2015版藥典)提取揮發(fā)油并進行改進，具體方法如下：稱取金銀花置燒瓶中，加適量水振搖混合后，連接揮發(fā)油測定器與回流冷凝管，自冷凝管上端加水使充滿揮發(fā)油測定器的刻度部分，并溢流入燒瓶時為止。置油浴鍋緩緩加熱至沸，提取過程始終保持微沸狀態(tài)，提取結(jié)束，停止加熱，放置，冷卻，自揮發(fā)油測定器上端加入適量乙醚溶解揮發(fā)油，分取乙醚層置已知重量的蒸發(fā)皿中，自然揮干乙醚，稱取揮發(fā)油重量，計算揮發(fā)油提取率。

2.2 單因素考察

2.2.1 金銀花粉碎程度對揮發(fā)油提取率的影響 分別取未粉碎金銀花、切段金銀花、30～40目金銀花細(xì)粉、20～30目金銀花細(xì)粉各100 g，分別加15倍量純化水浸泡1 h，按照“2.1”項下方法提取揮發(fā)油，提取時間7 h，計算揮發(fā)油提取率。不同粉碎程度對揮發(fā)油提取率的影響如圖1所示。

圖1 粉碎度對揮發(fā)油提取率的影響

由圖1可見，隨金銀花粒度的減小，揮發(fā)油提取率有降低的趨勢，本實驗選用未粉碎金銀花進行揮發(fā)油提取。

2.2.2 加水量對揮發(fā)油提取率的影響 取金銀花100 g，分別加入10倍、15倍、20倍、25倍純化水浸泡1 h，按照“2.1”項下方法提取揮發(fā)油，提取時間7 h，計算揮發(fā)油提取率。加水量對揮發(fā)油提取率的影響如圖2所示。

圖2 加水量對揮發(fā)油提取率的影響

由圖2可見，隨加水量的增加，揮發(fā)油提取率顯著增加，加水量達到15倍后，繼續(xù)增加用水量，揮發(fā)油提取率增加不明顯。

2.2.3 提取時間對揮發(fā)油提取率的影響 取金銀花100 g，加入15倍量純化水浸泡1 h，按照“2.1”項下方法提取揮發(fā)油，分別提取1 h、3 h、5 h、7 h、9 h、11 h、13 h、15 h，計算揮發(fā)油提取率。提取時間對揮發(fā)油提取率的影響如圖3所示。

圖3 提取時間對揮發(fā)油提取率的影響

由圖3可見，隨提取時間的延長，揮發(fā)油提取率明顯增加，提取時間增加到7 h后，隨提取時間延長，揮發(fā)油提取率變化不明顯。

2.2.4 浸泡時間對揮發(fā)油提取率的影響 取金銀花100 g，分別加入15倍量純化水浸泡0 h、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h，按照“2.1”項下方法提取揮發(fā)油，計算揮發(fā)油提取率。浸泡時間對揮發(fā)油提取率的影響如圖4所示。

圖4 浸泡時間對揮發(fā)油提取率的影響

由圖4可見，浸泡時間對揮發(fā)油提取率影響不大，浸泡1 h后隨浸泡時間的延長，揮發(fā)油提取率基本保持不變。本實驗選擇浸泡時間為1 h。

2.2.5 氯化鈉濃度對揮發(fā)油提取率的影響 稱取金銀花5份，每份100 g，分別用純化水，3%、5%、7%、10%氯化鈉溶液1 500 mL浸泡1 h，連接揮發(fā)油測定器與回流冷凝管，自冷凝管上端分別加入純化水，1%、3%、5%、7%、10%的氯化鈉溶液，充滿至揮發(fā)油測定器的1/2刻度部分為止。緩緩加熱至沸，提取過程始終保持微沸狀態(tài)，當(dāng)揮發(fā)油測定器中液面上升至滿量程刻度部分時，開啟活塞使液面上端下降至揮發(fā)油測定器刻度0線上面5 mm 處為止，再從冷凝管上端通過導(dǎo)管分別緩緩加入水或不同濃度的氯化鈉溶液至液面上升至揮發(fā)油測定器的1/2刻度部分為止，如此反復(fù)直至提取結(jié)束，提取時間7 h。提取結(jié)束后，停止加熱，放置，冷卻，自揮發(fā)油測定器上端加入適量乙醚溶解揮發(fā)油，分取乙醚層，置已知重量的蒸發(fā)皿中，自然揮干乙醚，稱取揮發(fā)油重量，計算揮發(fā)油提取率。鹽析液濃度對揮發(fā)油提取率的影響見圖5。

由圖5可見，隨氯化鈉濃度的升高，揮發(fā)油提取率顯著增加，氯化鈉濃度達到3%時，隨氯化鈉濃度的增加，揮發(fā)油提取率增加趨于緩慢。

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化[7-8]金銀花揮發(fā)油提取工藝

2.3.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果 在單因素試驗的基礎(chǔ)

圖5 氯化鈉濃度對揮發(fā)油提取率的影響

上，選擇對揮發(fā)油提取率影響較大的3個因素：加水量(A)、提取時間(B)及氯化鈉濃度(C)為考察因素，每個因素選擇3個水平，采用3因素3水平Box-Behnken試驗設(shè)計，按照“2.2.5”項下方法，以揮發(fā)油提取率作為考察指標(biāo)開展實驗。因素水平見表1，響應(yīng)面試驗方案及結(jié)果見表2。

2.3.2 模型評價 利用Design-Expert 軟件對表2試驗數(shù)據(jù)進行二次多項式逐步回歸擬合，得到的數(shù)學(xué)模型為：y=1.43-0.005 75A+0.020B+0.10C+0.013AB+0.001 5AC+0.003 25BC-0.013A2+0.031B2-0.087C2；R2=0.968 4。模型方差分析結(jié)果和各項系數(shù)顯著性檢驗結(jié)果列于表3，變異系數(shù)見表4。

表1 響應(yīng)面試驗因素及水平表

表2 響應(yīng)面試驗方案及結(jié)果

表3 二次多項模型方差分析

表4 變異系數(shù)

由表3及表4可知：失擬項P值為0.115 4>0.05，表明該模型擬合中，非正常誤差所占比例小，擬合度高；回歸模型的F=28.83，P=0.000 2<0.05，表明實驗所采用的二次模型是顯著的，在統(tǒng)計學(xué)上是有意義的，決定系數(shù)R2=0.968 4，說明該模型能解釋96.84%響應(yīng)值變化，表明該回歸方程可很好對響應(yīng)值的變化進行擬合，擬合度好。

因素C(氯化鈉濃度)的P值<0.000 1，說明因素C對提取率的影響是極顯著的。因素B2的P值=0.036 2<0.05，因素C2的P值=0.000 2<0.05，說明因素B2、C2對提取率具有顯著影響。因素A、B、AB、AC、BC、A2的P值均大于0.05，說明以上因素對提取率沒有顯著影響。

2.3.3 響應(yīng)面分析 由圖6 可以看出，在固定加水量和提取時間時，揮發(fā)油提取率隨氯化鈉濃度的增加顯著增大，表明氯化鈉濃度對揮發(fā)油提取率影響顯著。當(dāng)固定氯化鈉濃度時，提取率受加水量及提取時間的影響較小，揮發(fā)油提取率隨提取時間延長增加緩慢，隨加水量的增多，提取率呈凸型曲面變化，說明加水量過多對揮發(fā)油提取不利。

通過最優(yōu)化分析，最佳的提取條件為加水量21.59倍、浸泡1 h、提取時間11 h、氯化鈉濃度8.67%，預(yù)測提取率為1.518 99‰。根據(jù)實際情況，將加水量調(diào)整為20倍，浸泡時間為1 h，提取時間7 h，氯化鈉濃度8.5%。

圖6 三因素對揮發(fā)油提取率的效應(yīng)面及等高線：A(提取時間和加水量)；B(氯化鈉濃度和加水量)；C(提取時間和氯化鈉濃度)

2.4 驗證實驗

稱取金銀花100 g，加8.5%氯化鈉溶液2 000 mL浸泡1 h，連接揮發(fā)油測定器與回流冷凝管，自冷凝管上端加入8.5%的氯化鈉溶液，充滿至揮發(fā)油測定器的1/2刻度部分為止。置油浴鍋緩緩加熱至沸，提取過程始終保持微沸狀態(tài)，當(dāng)揮發(fā)油測定器中液面上升至滿量程刻度部分時，開啟活塞使液面上端下降至揮發(fā)油測定器刻度0線上面5 mm處為止，再從冷凝管上端通過導(dǎo)管緩緩加入8.5%的氯化鈉溶液至液面上升至揮發(fā)油測定器的1/2刻度部分為止，如此反復(fù)直至提取結(jié)束。提取結(jié)束后，停止加熱，放置，冷卻，自揮發(fā)油測定器上端加入適量乙醚溶解揮發(fā)油，分取乙醚層置已知重量的蒸發(fā)皿中，自然揮干乙醚，稱取揮發(fā)油重量，計算揮發(fā)油提取率。結(jié)果三批揮發(fā)油提取率分別為1.497 3‰、1.501 6‰、1.500 7‰，平均提取率為1.499 8‰。

3 討論

金銀花中揮發(fā)油含量較低，而水蒸氣蒸餾法提取金銀花揮發(fā)油時，部分揮發(fā)性物質(zhì)溶于水中，致使揮發(fā)油提取率更低。中國藥典2015版采用加入氯化鈉的方法降低金銀花揮發(fā)性物質(zhì)在金銀花露中的溶解度[4]，進一步通過水蒸氣蒸餾的方法提取金銀花露中的揮發(fā)性物質(zhì)進行質(zhì)量控制。本文將此方法用于金銀花揮發(fā)油的提取，探索水蒸氣蒸餾鹽析法各工藝參數(shù)與揮發(fā)油提取率的關(guān)系，優(yōu)選工藝參數(shù)。

以金銀花揮發(fā)油提取率為指標(biāo)，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面優(yōu)化法探索金銀花揮發(fā)油提取工藝參數(shù)，經(jīng)方差分析表明擬合度較好，模型優(yōu)選的最佳提取工藝為加

水量為21.59倍、浸泡1 h、提取時間11 h、氯化鈉濃度8.67%，預(yù)測提取率為1.518 99‰，考慮實際提取時，各參數(shù)難以控制到模型優(yōu)選的精密度，同時考慮耗能情況，將工藝參數(shù)調(diào)整為加水量20倍、浸泡時間1 h，提取時間7 h、氯化鈉濃度8.5%。在此條件下?lián)]發(fā)油平均提取率為1.499 8‰。