不同產地望春花藥材中揮發油的化學成分分析

萬楷楊，李秋芳

(1.鄭州市第一人民醫院，河南 鄭州 450004；2.河南省中醫院，河南 鄭州 450006)

望春花為木蘭科植物望春花MagnoliabiondiiPamp.的干燥花蕾，其性溫，味辛，歸肺、胃經，具有散風寒、通鼻竅的功效[1]。辛夷為河南省的道地藥材，原產湖北，今分布于河南、湖北、陜西及四川等省，多為栽培，少有野生[2]，河南省野生品種多為望春花，望春花花蕾為辛夷藥材來源的主流品種，約占辛夷藥材的80%。南北朝《名醫別錄》[3]中記載產地有“漢中，魏興，梁州川谷”，說明辛夷長在漢中(今陜西西南部)、魏興(今陜西東南部)、梁州(今陜西西南部)等地的山川河谷地帶。《本草衍義》[4]中記載全國各地均有辛夷，《本草圖經》[5]中初次出現了“人家園庭亦多種植”，表明此時辛夷的種植已較為常見，各個產地皆有種植。清代《本草崇原》[6]中記載“今近道處處有之”，近道即中原一帶，即現代河南省及其毗鄰地區。現代《中國藥材學》[7]中記載：“分布于甘肅、陜西、湖北、河南、四川、湖南，生于海拔400～2 000 m山地”“以四川、河南產量大，質量佳。”辛夷的藥用及香用有效成分均為其所含的揮發油[8]。其主要化學成分有單萜、倍半萜類及其含氧衍生物和脂肪族化合物等[9]。但目前對望春花的開發利用僅限于精油提取和鼻炎用藥，許多其他藥理作用尚沒有充分開發[10]。王文魁等[8]對望春花油的藥理效應進行了實驗研究，證明其有明顯的抗炎作用。管正等[11]發現了辛夷揮發油可減輕實驗性變應性鼻炎(AR)大鼠的炎癥反應，說明辛夷揮發油的抗組胺和乙酰膽堿作用是其發揮抗炎、抗過敏作用的藥理基礎。陳志東等[12]建立腎缺血再灌注損傷大鼠模型，觀察辛夷揮發油治療前后腎組織病理學與腎功能改變的表達，說明辛夷揮發油對腎臟具有保護作用。另外辛夷揮發油能抑制活化的人內皮細胞與中性粒細胞黏附，從而發揮抗炎與抗黏附效應。因此，本文研究不同產地望春花揮發油的化學成分，以期對望春花揮發油的質量評價提供依據。

1 儀器與材料

1.1 實驗儀器

TSQ8000EVO三重四極桿氣質聯用儀(美國賽默飛世爾公司)；NIST標準質譜圖庫；BSA124S萬分之一分析天平(賽多利斯科學儀器有限公司)、DGX-9143B型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海南榮實驗室設備有限公司)；KQ-500DV 型數控超聲波清洗器( 昆明市超聲儀器有限公司)，揮發油提取器、KDM 型調溫電熱套(山東菏澤石油化工學校儀器設備廠)。

1.2 實驗材料

樣品收集于廣西、湖北、四川、安徽、河南共14份樣品。經河南中醫藥大學董誠明教授鑒定為木蘭科Magnoliaceae植物望春花MagnoliabiondiiPamp.的干燥花蕾。具體樣品見表1。

2 實驗條件

2.1 提取方法

取供試品30 g稱量(準確至0.01 g)至燒杯中，加水500 mL與玻璃珠數粒，振搖混勻后，連接揮發油測定器與回流冷凝管。自冷凝管上端加水使充滿揮發油測定器的刻度部分，并溢流入燒瓶中為止。置電熱套中緩緩加熱至沸騰，并保持微沸約5 h，至測定器中油量不再增加，停止加熱，放置片刻，開啟測定器下端的活塞，將水緩緩放出，至油層上端到達刻度0線上面5 mm處為止。放置1 h以上，再開啟活塞使油層下降至其上端恰與刻度0線平齊，讀取揮發油量，并計算供試品中含揮發油的百分數。

表1 實驗樣品

2.2 實驗條件

2.2.1 色譜柱 TG-5MS(30 m×0.25 mm，0.25 μm)石英毛細管柱；程序升溫：40 ℃，保持3 min，先以2 ℃/min升溫至60 ℃，然后以4 ℃/min升溫至90 ℃，再以3 ℃/min升溫至160 ℃，最后以20 ℃/min升溫至260 ℃，恒溫5 min，進樣口溫度：260 ℃；載氣：氦氣；載氣流速：1.0 mL/min；分流比：100∶1；溶劑延時：5 min。質譜條件：離子源：EI源；離子源溫度：250 ℃；四級桿溫度：150 ℃；傳輸線溫度；280 ℃電子能量：70 eV；倍增管電壓：1.2 kV；接口溫度：280 ℃；質量范圍：35～550 m/z。

2.2.2 供試品溶液制備方法 稱量望春花樣品30 g，加入500 mL蒸餾水蒸餾5 h，得到淡黃色油狀物，用石油醚萃取，無水硫酸鈉干燥、放置過夜，過濾后用旋轉蒸發儀揮干石油醚溶液，得到望春花揮發油。取5 μL揮發油，用二氯甲烷定容至1 mL，稀釋200倍，待測。

2.2.3 測定方法 分別吸取對照品溶液與供試品溶液1 μL，注入GC-MS聯用儀，記錄55 min色譜圖。

3 實驗結果

對實驗樣品所得GC-MS圖譜手動選取所有樣品的共有峰，26個共有峰的總貢獻率>90%，可以代表樣品的全部信息。

3.1 辛夷揮發油化學指標的聚類分析

3.1.1 原始數據標準化 為了消除量綱的影響，首先將數據進行標準化。

3.1.2 進行聚類分析 采用樣本聚類分析，方法上采用相關系數法，得到聚類樹狀圖，見圖1。

3.2 望春花質量評價主成分分析

3.2.1 標準化處理 由于原始數據存在數量級上的差異，故首先將供試材料化學指標的含量標準化。

3.2.2 主成分的確定 計算相關系數的特征根和方差貢獻率見表2，從表2可以看出第1、2、3、4主成分的累計方差貢獻率為91.85%>80%，所以選取4個主成分進行評價，代表望春花91.85%的信息。

圖1 聚類分析樹狀圖

主成分數特征根方差貢獻率(%)方差總貢獻率(%)115.6060.0160.0124.0315.5175.5232.419.2684.7841.847.0891.85

3.2.3 計算初始因子載荷矩陣 通過SPSS分析得到的4個初始因子的載荷矩陣見表3，從初始矩陣計算得到的4個主向量矩陣見表4，從而得到4個主成分與各個變量的線性組合分別如下：

F1=0.197ZX1-0.212ZX2+0.217ZX3+……+0.213ZX26

F2=-0.257ZX1-0.089ZX2-0.205ZX3+……+0.037ZX26

F3=0.114ZX1-0.275ZX2-0.075ZX3+……-0.037ZX26

F4=0.041ZX1-0.027ZX2-0.009ZX3+……+0.120ZX26

表3 初始因子載荷矩陣

續表3

1234Zscore(峰4)0.815-0.3870.2540.093Zscore(峰5)0.848-0.4620.0270.227Zscore(峰6)0.826-0.3270.3190.279Zscore(峰7)0.764-0.020.1-0.503Zscore(峰8)0.859-0.3940.0860.244Zscore(峰9)0.8240.2270.2120.317Zscore(峰10)-0.899-0.139-0.241-0.069Zscore(峰11)0.5640.0530.732-0.212Zscore(峰12)0.3240.5390.362-0.64Zscore(峰13)0.3680.8430.2380.164Zscore(峰14)0.7230.604-0.199-0.169Zscore(峰15)0.7220.53-0.0390.299Zscore(峰16)0.7490.519-0.0860.277Zscore(峰17)-0.8650.3350.1430.287Zscore(峰18)0.6670.517-0.3740.28Zscore(峰19)0.5910.514-0.4850.142Zscore(峰20)-0.8320.3030.4040.115Zscore(峰21)-0.8630.3980.281-0.098Zscore(峰22)-0.910.1390.3180.134Zscore(峰23)-0.823-0.122-0.3840.12Zscore(峰24)-0.8170.0030.3770.391Zscore(峰25)-0.815-0.1280.2990.433Zscore(峰26)0.8410.074-0.0570.163

表4 主成分向量

3.2.4 計算主成分得分及綜合得分并排序 以每個主成分所對應的方差貢獻率占所提取主成分的總的方差貢獻率之和的比例作為權重計算主成分綜合模型，即F=0.653F1+0.169F2+0.101F3+0.077F4計算綜合分。具體得分及排序見表5。

表5 綜合得分及排序

3.3 化學成分分析

通過對望春花揮發油進行提取分析，得到總離子流圖，見圖2。然后，通過Xcalibur化學工作站檢索Nist標準質譜圖庫，同時結合有關質譜圖文獻解析，以匹配度大于750為篩選依據[13]，并選取所有樣品共有峰，共有峰總貢獻率均>90%，可代表望春花揮發油的總體信息，并初步鑒定了其中 26個揮發性成分，結果見表6，通過GC-MS分析，經面積歸一法計算得出各個樣品共有峰的相對百分含量，見表7。

圖2 望春花揮發油總離子流

表6 望春花揮發油化學成分

4 結果分析

4.1 聚類分析意義

通過聚類分析樹狀圖1的結果可以看出，在產地上，樣品9、10、11、12、13、14聚為一類，即產地為河南。其他樣品即廣西、湖北、四川、安徽聚為一類。由此可見，道地藥材聚為一類，非道地藥材聚為一類，道地藥材可與非道地藥材分開，望春花藥材的揮發油成分與產地之間具有一定相關性，可能與其生長環境、氣候、海拔、土壤等有關。

4.2 主成分結果分析

4.2.1 望春花揮發油主成分意義 據表2、表3可知，第一主成分特征根為15.602，累計貢獻率為60.01%，即一個因子模型解釋了樣品60.01%的信息，在峰1、3、4、5、6、7、8、9的載荷系數較大，且為正相關，可視為1、3、4、5、6、7、8、9為含量主因子，結合化學成分分析，可知其含量主因子為α-蒎烯、β-蒎烯、香檜烯、α-月桂烯、桉樹腦、芳樟醇、γ-松油烯、檸檬烯等；第二主成分在峰12、13、14的載荷系數較大，且為正相關，可視為峰12、13、14為含量主因子，結合化學成分分析，可知其含量主因子為α-松油醇、β-石竹烯等；第三主成分在峰11、12的載荷系數較大，且為正相關，可視峰11、12為含量主因子，結合化學成分分析，可知其含量主因子為α-松油醇、β-欖香烯等。這三個主成分對樣品的貢獻率為84.776%，可通過這三個主成分確定望春花揮發油的主要化學成分為α-蒎烯、β-蒎烯、香檜烯、桉樹腦、α-松油醇。

4.2.2 望春花揮發油主成分綜合評價 據表5可知，可得出不同產地的望春花揮發油質量優劣的綜合評價結果，樣品9、10、11、12、13、14排名較靠前，表明其揮發油成分較好。且這些產地樣品均采集于河南，由此可見，在望春花揮發油成分上，河南省所產望春花要優于其他省份。結合表7各個樣品的化學成分的含量分析，可以看出在α-蒎烯、香檜烯這兩個成分上，河南、湖北的樣品含量要高于其他產地；在桉樹腦、α-松油醇成分上，河南、安徽的樣品含量要高于其他產地；在β-蒎烯成分上，湖北、安徽的樣品含量高于其他產地；綜合這五個成分的含量比較，可以看出在望春花揮發油的總成分上，河南省的質量較優。

5 討論

由于望春花的產地較多，難以從提取的揮發油上來區分其產地并評價其質量，因此，通過GC-MS技術對望春花揮發油進行綜合分析，并通過聚類分析和主成分分析法對望春花揮發油的圖譜進行分析，聚類分析以“物以類聚”的思想，通過計算樣品間的聚類統計量(距離、相關系數等)，逐步將相關性最大的樣品聚在一起，直到所有樣品歸為一類[14]，可以直觀地看出其中河南的樣品聚為一類，其他樣品聚為一類，說明望春花藥材的揮發油成分與產地之間具有一定相關性。可能與其生長環境、氣候、海拔、土壤等有關；主成分分析作為數據挖掘的一種方法能夠用于中藥指紋圖譜的統計分析。在不損失樣本特征值的數量和信息前提下，采用降維模式分類方法，僅用4個主成分就能基本描述望春花藥材揮發油圖譜中原有的多維數據特征，起到了降維作用，便于數據分析，而且原有信息損失少[15]。盧金清等[9]分析了望春花揮發油中的化學成分，其中桉樹腦含量最高，其次為β-蒎烯和α-松油醇。王娟等[16]通過對望春花揮發油指紋圖譜的研究，指認了其中的三個主要成分為α-蒎烯、β-蒎烯、檜烯，并對不同產地的樣品進行聚類分析及這三個成分的含量對比分析，得出河南、安徽兩個產地的樣品可聚為一類，與其他產地樣品可區分開，與本實驗聚類分析結果保持一致，再次驗證了望春花在地域方面的差異。本文通過指認的5個化學成分(α-蒎烯、β-蒎烯、香檜烯、桉樹腦、α-松油醇)的含量比較，發現河南的樣品這五個成分的含量均在前三名中分布，再結合主成分的綜合得分，能對不同產地望春花藥材揮發油的質量作出綜合評價，其中河南的望春花綜合得分排名第一位，并與聚類分析結果相統一，而且在α-蒎烯、β-蒎烯、香檜烯、桉樹腦、α-松油醇這五個成分上，排名都很靠前，可見河南省所產望春花揮發油優于其他省份，可作為區分望春花道地藥材與非道地藥材的依據，這為望春花藥材揮發油的進一步利用提供了可靠的理論依據。