星點設計-響應面法優化大黃中大黃素的勻漿提取工藝研究

古炳明

(梅州市食品藥品監督檢驗所，廣東 梅州 514071)

大黃是中國傳統的中藥，收載于2015版《中國藥典》一部，來源于寥科植物掌葉大黃palmatumL.、唐古特大黃RheumtanguticumMaxim，ex Balf.或藥用大黃RheumofficinaleBaill.的干燥根和根莖[1]。據統計，關于大黃主要活性物質的研究中對蒽醌類成分的研究最多，蒽醌類成分的平均總量約為3%～5%，以游離型蒽醌類和結合型蒽醌類兩種形式存在[2-3]。在2015版《中國藥典》中，大黃含量測定采用以甲醇作為溶劑，回流1h的方法對蒽醌類成分進行提取，此法操作較繁瑣，耗時較長，工作效率較低。高速勻漿法是先將物料與提取溶劑混合后，利用勻漿儀內流體力學和高速機械剪切刀的工作，將物料研磨成均勻的糊狀物，從而達到粉碎與提取有效成分的目的[4]。此方法粉碎效果好，具有工作效率高、能耗低、經濟環保等優點。目前關于高速勻漿法提取大黃蒽醌類成分的工藝研究未見報道，本實驗旨在利用星點設計效應面法找尋一種節能、高效、操作便利的提取工藝以提高工作效率，現將實驗過程報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent1100高效液相色譜儀；Agilent ZORBAX SB-C18柱：(4.6 mm×250 mm，5 μm，SN：USCL054036)；Sartorius BP211D電子分析天平(十萬分之一)；AB204-N電子分析天平(萬分之一)；ULUP-I-10T純水系統；IKA高速勻漿機；IKA中藥材粉碎機。

1.2 試藥與試劑

大黃素(批號：110756-200110，由中國藥品生物制品檢定所提供)；大黃(批號：17040910，安徽協和成藥業飲片有限公司)；甲醇(批號：503332-08444，天津市四友精細化學品有限公司出品，河北四友卓越科技有限公司制造)，磷酸(批號：20160520，天津市科密歐化學試劑有限公司)均為色譜純；水為超純水；甲醇(批號：20170301-2，廣州化學試劑廠)，乙醇(批號：20170702-2，廣州化學試劑廠)，乙酸乙酯(批號：20161201-2，廣州化學試劑廠)均為分析純。試驗用大黃均經梅州市食品藥品監督檢驗所陳繁華副主任中藥師鑒定為藥典來源大黃。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18柱：(4.6 mm×250 mm，5 μm，SN：USCL054036)；流動相為甲醇-0.1%磷酸溶液(85∶15)；流速：1 mL/min；檢測波長：254 nm；柱溫箱溫度為30 ℃；進樣體積10.0 μL，理論塔板數按大黃素計算應不少于3 000[1]。

2.2 對照品溶液的制備

取大黃素對照品10.85 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解，并稀釋至刻度，搖勻，精密量取8 mL，置100 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即可得對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取大黃粉末(過四號篩)約0.5 g，精密稱定，置燒杯中，精密加入甲醇25 mL，提取3 min，轉速10 000 r/min，濾過，取續濾液，即可得供試品溶液。

2.4 對照品及樣品測定

分別按“2.1.2”“2.1.3”項下方法制備對照品、供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進樣分析。見圖1 。

注：1．大黃素

2.5 單因素試驗

2.5.1 提取溶劑對有效成分的影響 取大黃粉末(過四號篩)，精密稱取3份各0.5 g，分別精密加入甲醇、乙醇、乙酸乙酯各25 mL，勻漿3 min，轉速10 000 r/min，濾過，取續濾液，即得。測定大黃素含量，平行6次，求平均值。甲醇提取的大黃素含量最高。

2.5.2 勻漿轉速對有效成分的影響 取大黃粉末(過四號篩)，精密稱取6份各0.5 g，精密加入甲醇25 mL，勻漿3 min，轉速分別為6 000 r/min、8 000 r/min、10 000 r/min、12 000 r/min、14 000 r/min、16 000 r/min，濾過，取續濾液，即得。測定大黃素含量，平行6次，求平均值。當勻漿轉速為10 000r/min時，大黃素含量最高。

2.5.3 勻漿時間對有效成分的影響 取大黃粉末(過四號篩)，精密稱取6份各0.5 g，置燒杯中，精密加入甲醇25 mL，轉速10 000 r/min，勻漿提取時間分別為1 min、2 min、3 min、4 min、5 min、6 min，濾過，取續濾液，即得。測定大黃素含量，平行6次，求平均值。當勻漿時間為4 min時，大黃素含量最高。

2.5.4 溶劑體積對有效成分的影響 取大黃粉末(過四號篩)，精密稱取9份各0.5 g，分別精密加入甲醇10 mL、15 mL、20 mL、25 mL、30 mL、35 mL、40 mL、45 mL、50 mL，提取4 min，轉速10 000 r/min，濾過，取續濾液，即得。測定大黃素含量，平行6次，求平均值。當甲醇體積為40 mL時，大黃素含量最高。

2.5.5 溶劑體積分數對有效成分的影響 取大黃粉末(過四號篩)，精密稱取6份各0.5 g，分別精密加入體積分數為50%、60%、70%、80%、90%、100%的甲醇40 mL，提取4 min，轉速10 000 r/min，濾過，取續濾液，即得。平測定大黃素含量，平行6次，求平均值。當甲醇體積分數為80%時，大黃素含量最高。

2.6 星點設計試驗優化大黃中大黃素勻漿提取工藝

2.6.1 星點設計 經單因素考察確定溶劑為甲醇，以勻漿轉速、時間、甲醇體積及甲醇體積分數(%)為考察因素，以大黃素含量為響應值，每個因素設5個水平，并以-2、-1、0、1、2表示自變量的水平高低，按表1方案試驗，結果見表2。

表1 勻漿提取星點設計因素及水平

表2 勻漿提取大黃中大黃素試驗設計及結果

2.6.2 結果分析 采用Design-Expert 8.0.5軟件對表2結果進行處理，以勻漿轉速(A)、時間(B)、甲醇體積(C)和甲醇體積分數(D)為自變量，大黃素含量(Y)為響應值進行線性及多項式擬合，根據P值和r值來判定模型的好壞。對其進行模型擬合分析，可得二項式擬合方程：

Y=-0.40 998+5.97 917×10-6A+0.031 542B-3.51 667×10-3C+0.012 288D-3.12 500×10-7AB+5.00 000×10-8AC-5.62 500×10-8AD-1.50 000×10-4BC-1.37 500×10-4BD-2.50 000×10-5CD-3.64 583×10-11A2-1.02 083×0-3B2+6.41 667×10-5C2-6.02 083×10-5D2(P<0.05，r=0.8 897)

其模型項P<0.05，提示Y與A、B、C、D回歸關系顯著，失擬項P>0.05，提示其他未知因素對實驗結果的干擾較小，模型相關系數r=0.8897，模型可信度高，此方程與實際情況擬合較好，可對大黃中大黃素的勻漿提取工藝進行較好預測。A、B及D均P<0.05，提示上述因素對提取大黃中的大黃素影響顯著。各因素對提取大黃中的大黃素的影響順序為：甲醇體積分數>勻漿時間>勻漿轉速>甲醇體積。

2.6.3 效應面優化和預測 根據回歸方程，在保持2個因素編碼值為0時，再對其他兩個因素進行分析，通過Design-Expert 8.0.5軟件繪制大黃素含量與4個自變量的等高線圖及三維響應面圖，見圖2、圖3。

圖2 各因素對勻漿提取大黃素的等高線

圖3 甲醇體積分數、甲醇體積對勻漿提取大黃素的響應面

從圖2可看出，各因素之間的等高線圖不是趨向于橢圓，表明它們之間的交互作用影響不明顯；由圖3可知，甲醇體積分數的曲面較陡峭，說明甲醇體積分數對大黃素含量的影響最大，隨著甲醇體積分數增加，大黃素含量也逐漸增加，當甲醇體積分數上升到82%～85%時，大黃素含量達到了最大值，之后隨著甲醇體積分數的增加，大黃素含量也逐漸下降。

2.6.4 條件優化及驗證試驗 以Design-Expert 8.0.5軟件預測分析，得出勻漿提取最佳工藝為：轉速為11 999.99 r/min，時間為5 min，甲醇體積為35 mL，甲醇體積分數為83.5%，在此條件下預測出大黃素含量為0.139%。根據實際，最終確定最佳提取工藝為：轉速為12 000 r/min，時間為5 min，甲醇體積為35 mL，甲醇體積分數為83.5%，按此提取工藝條件提取大黃中的大黃素，平行試驗3次，結果見表3，實測值與理論預測值間相對誤差RE均在5%以下，提示本研究優化的勻漿提取大黃中大黃素的提取條件參數準確可靠。

表3 星點設計-效應面法優化處方驗證試驗結果

注：相對誤差RE=(預測值-實測值)/預測值×100%。

2.7 高速勻漿提取與回流提取效果對比

以2號樣品分別精密稱取0.5 g各6份，按《中國藥典》一部下提取方法與本研究優化后的提取方法進行提取后，以HPLC法對大黃素含量進行測定，計算RSD值為1.39%。

3 討論

大黃游離蒽醌類成分在甲醇、乙醇、乙酸乙酯中均可溶，故選擇上述溶劑進行考察，發現甲醇提取大黃素的含量最高，乙醇次之，乙酸乙酯最低，且從色譜圖上發現乙酸乙酯提取的游離蒽醌類成分不完全。本研究選取提取溶劑體積、體積分數、轉速及勻漿時間4個參數進行優化。在提取溶劑體積方面，體積過少無法充分地浸潤物料，使目標成分溶解受限。但本研究單因素發現甲醇體積達40 mL后，隨著甲醇體積的增加，目標成分含量開始下降?？赡芤蛉軇┻^多勻漿轉頭與物料接觸不夠充分，物料粉碎不足而使目標成分溶出不全。在溶劑濃度方面，隨著甲醇濃度增大，大黃素含量逐漸升高，提示適量的水分可促進溶劑浸入細胞內部，可更好地溶解目標成分而在一定程度上提高提取效率。在甲醇濃度達到80%之后，隨著甲醇濃度的增大，大黃素的含量呈下降趨勢，可能與此時提取溶劑中水的比例下降，極性相應有所下降，在此極性范圍內不適宜目標成分的溶解。理論上來說轉速越大，物料粉碎效果越好，目標成分提取效率越高，但轉速過大時可能導致目標成分結構被破壞而使含量不升反降。本研究發現在轉速為16 000 r/min時，大黃素含量明顯下降，可能與過大的轉速破壞了大黃素的結構有關。勻漿時間越長，物料粉碎越充分，大黃素含量理論上應有所提高，但在單因素分析時發現勻漿時間增加到4 min之后，隨著勻漿時間的增加，大黃素含量反而下降，可能隨著時間增加物料過度粉碎，使勻漿液黏度增加，濾過時單位時間內通過的目標成分量下降而使其含量下降。因大黃中大黃素提取受上述因素的綜合影響，故在單因素分析的基礎上進行星點設計-響應面法優化提取工藝，以分析各因素綜合作用的影響[5]。