花煙草NaNHX1 基因的克隆及其在非生物脅迫下的 表達模式

魯琳 趙希勝 劉維東 王艷婷 吳玲莉 魯黎明

（1. 四川農(nóng)業(yè)大學風景園林學院，成都 611130；2. 四川農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，成都 611130）

植物在生長過程中，易遭受到土壤鹽漬化的威脅，造成其生長發(fā)育受阻，嚴重時會導致植物的死亡［1］。研究表明，高濃度的土壤鹽分，主要從離子毒害和滲透脅迫兩個方面來危害植物的正常生長，而位于植物細胞膜系統(tǒng)的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白（Na+/H+exchange or antiporter，NHX），則是植物抵御鹽脅迫的重要組分［2-5］。

NHX 蛋白在植物中主要定位于質(zhì)膜（Plasma membrane，PM）及細胞內(nèi)部（Intra-cellular，IC），后者又可分為定位于液泡膜及類囊體膜兩類［2-3］。NHX 蛋白的主要功能是參與植物的鹽脅迫響應［1-5］，除此之外，其還廣泛參與了植物的生長發(fā)育過程，如調(diào)控植物的生長、參與葉片及花的發(fā)育及花色形成等［2-3，6-8］。鹽脅迫下，位于植物細胞膜系統(tǒng)的H+-ATPase 和H+-PPase，建立了跨膜的電化學勢梯度，并由此驅(qū)動NHX 將細胞質(zhì)內(nèi)過多的Na+排出細胞或區(qū)域化到液泡中，從而避免或減輕了Na+對植物細胞的傷害［2-5，8］。

植物首先被發(fā)現(xiàn)的NHX基因，是擬南芥的AtNHX1［9］，該基因被證明是擬南芥主要的抗旱與抗鹽基因。隨著分子生物學技術(shù)的不斷進步以及植物NHX基因研究的不斷深入，越來越多的植物NHX基因被克隆出來，并進行了功能分析，如擬南芥、水稻、大麥、小麥、番茄、菊花、棉花等［1，10-17］。

花煙草是屬于茄科煙草屬的一年生草本觀賞花卉，其花色種類繁多、花期較長，是優(yōu)美的花壇、花鏡材料，是我國許多城市重要的綠化美化材料。所以，研究其NHX基因的定位、表達模式及功能等，對于探索花煙草的生長發(fā)育以及響應逆境脅迫的機制具有重要意義。因此，本研究利用同源克隆的方法，克隆了一個花煙草的NHX基因，并采用生物信息學方法初步分析了該基因及其編碼蛋白的序列及結(jié)構(gòu)特征。同時，采用qRT-PCR 的方法，分析了該基因在多種非生物脅迫下的表達模式，以期為花煙草NHX基因的功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

以花煙草（Nicotiana alata）為實驗材料。

1.2 方法

1.2.1 植物材料的培養(yǎng)及非生物脅迫處理 材料培養(yǎng)：挑選籽粒飽滿且大小一致的種子，用次氯酸鈉溶液表面消毒后，用無菌水清洗數(shù)次，隨后播種于MS 培養(yǎng)基上，并置于恒溫培養(yǎng)室中生長（光照：16h光/8h暗；溫度：25℃）。

非生物脅迫處理及取材：待煙苗生長4 周后，取10 株幼苗，在液氮中速凍，用于目的基因的克隆。同時，挑選長勢一致的煙苗，分別進行低溫（4℃）、干旱（5% PEG6000）、高鹽（200 mmol/L）、低鉀（10 μmol/L）、ABA（1 μmol/L）及H2O2（10 mmol/L）處理，每個處理設(shè)3 個重復，每重復15 株煙苗。在處理0 h、3 h、6 h、12 h、24h后，分處理、重復進行整株取樣，并置于液氮中保存，用于總RNA 的提取。

低鉀MS 培養(yǎng)基（鉀離子終濃度為10 μmol/L）的配制，參照張雪微等方法進行［18］。

此外，分別取正常生長8 周煙苗的根、莖、葉，以及處于盛花期的煙花，保存于液氮中，用于目的基因的組織表達分析。

1.2.2 目的基因克隆 總RNA 的提取及反轉(zhuǎn)錄：采用Trizol 法提取煙苗的總RNA［19］，然后，參照cDNA 合成試劑盒的方法，進行反轉(zhuǎn)錄及cDNA 合成。

目的基因的克隆：參照煙草的NHX基因序列，利用Primer Premier5軟件設(shè) 計PCR引物：NaNHX1-F：5'-GCCCATGGAACAAGAACAAGTATATGA-3'，NaNHX1-R：5'-GCCCTAACTAGGACAAAACATTTG-3'，以合成的cDNA 為模板進行PCR 擴增。反應程序為：98℃5min；94℃ 30 s；53℃ 30 s；72℃2min；35 個循環(huán)；72℃ 10 min；12℃終止。PCR反應體系 為（25 μL）：cDNA模板1 μL，Taq Buffer（10×）5 μL，2.5 mol/L dNTP2μL，正反引物各1 μL，Taq酶1 μL，ddH2O 14 μL。PCR 反應結(jié)束 后，將產(chǎn)物進行凝膠電泳，回收并純化目的片段，連接pEASY-Blunt Simple 克隆載體，轉(zhuǎn)化Trans1-T1感受態(tài)細胞，在含有氨芐青霉素抗性平板上篩選，挑取陽性單克隆進行菌液PCR 驗證后，送至上海生工生物工程技術(shù)有限公司測序。

1.2.3 生物信息學分析 利用DNAMAN8 軟件對測序正確的序列進行分析，并翻譯成氨基酸序列。用ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）對其基本理化性質(zhì)進行分析，用ProtScale（http：//web.expasy.org/protscale/）預測蛋白親/疏水性。用CDD（http：//smart.embl-heidelberg.de/）預測蛋白結(jié) 構(gòu)域。 用Cell-PLoc 2.0（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）進行亞細胞定位的預測分析，用NetPhos3.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）預測磷酸化位點，用SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/）和Phyre2 分別進行目的蛋白的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)預測。利用NCBI Blast（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）在線工具，搜索同源基因，并運用MEGA7 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.2.4 目的基因的組織表達及響應非生物脅迫的誘導表達分析 引物設(shè)計：采用Primer Premier 5軟件，進行引物設(shè)計，用于目的基因的組織表達及響應非生物脅迫的誘導表達分析。正向引物：NaNHX1-qF：5'-GCCTCTGAACCTATTGCC-3'，反向引物：NaNHX1-qR：5'-TGCCACGATAAAGGACTG-3'；內(nèi)參為花煙草18S rRNA，引物序列為18S-F：5'-CCTACGCTCTGTATACATTAGC-3' ；18S-R ：5'-GTGTTGAGTCAAATTAAGCCGC-3'。

目的基因的組織表達及受誘導表達分析：按上述方法提取樣品的總RNA，并進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，具體方法參見1.2.2。以花煙草18S rRNA 為內(nèi)參，以cDNA 為模板，依據(jù)張雪薇等［18］的方法，進行目的基因片段的qRT-PCR 擴增，并計算目的基因的表達量，利用EXCEL 軟件做圖。

2 結(jié)果

2.1 目的基因的克隆

以花煙草幼苗為材料提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄后進行PCR 擴增，用1% 瓊脂糖凝膠電泳，在1 500 bp-2 000 bp 之間有一條清晰明亮的條帶（圖1）。條帶經(jīng)回收純化后送樣測序。將測序結(jié)果用DNAMAN8 進行分析并翻譯成蛋白序列。同時，在NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/） 網(wǎng)站上分析其ORF 序列。結(jié)果（圖2）顯示，該基因ORF 長度為1 599 bp，編碼532 個氨基酸。

圖1 NaNHX1 基因克隆

在NCBI 上，用BLAST 對目的基因的CDS 序列進行比對，結(jié)果表明，該基因與多個物種的NHX基因同源性較高。于是將目的基因命名為NaNHX1。

2.2 NaNHX1蛋白的生物信息學分析

2.2.1 理化性質(zhì)分析 采用Protparam 在線軟件，對NaNHX1 蛋白的理化性質(zhì)進行了分析。結(jié)果顯示，NaNHX1 由532 個氨基酸構(gòu)成，分子量為：58 442.43 Da；理論pI 為：5.66，不穩(wěn)定指數(shù)為：42.43，可能為不穩(wěn)定蛋白。其脂肪系數(shù)為98.80，帶負電荷的殘基（Asp+Glu）總數(shù)為42 個，帶正電荷的殘基（Arg+Lys）總數(shù)為30 個。該蛋白氨基酸組成中，含量較高的氨基酸包括亮氨酸60 個（Leu，占11.3%）、絲氨酸52 個（Ser，占9.8%）、甘氨酸49 個（Gly，占9.2%），半胱甘酸（Cys）和色氨酸（Trp）含量較低，各占氨基酸總數(shù)的0.6%。

2.2.2 親/疏水性分析 利用ExPaSy 網(wǎng)站的Prot-Scale，選擇Hphob./ Kyte&Doolittle 算法，對NaNHX1蛋白的親/疏水性進行了分析。結(jié)果顯示，NaNHX1蛋白序列中第424 位氨基酸最高分值為3.667，第513 位氨基酸最低分為-2.811，疏水性氨基酸個數(shù)總體上多于親水性氨基酸個數(shù)，且平均分值大于親水性氨基酸。同時，NaNHX1 蛋白的平均親水系數(shù)（GRAVY）為0.424。由此可推測，NaNHX1 蛋白屬于疏水性蛋白。

2.2.3 跨膜結(jié)構(gòu)預測 為了明確NaNHX1 是否為跨膜蛋白，采用TMHMM Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）分析軟件，對NaNHX1 的跨膜區(qū)進行了分析。從分析的結(jié)果可以看出，NaNHX1蛋白含有10 個跨膜區(qū)，分別位于第22-44、49-71、84-106、116-138、223-245、265-287、307-329、344-366、383-402 及412-434 位氨基酸（圖2）。因 此，可以推斷，NaNHX1 很可能是一個跨膜蛋白，承擔了花煙草的物質(zhì)跨膜運輸任務。

圖2 NaNHX1 蛋白跨膜區(qū)分析

2.2.4 亞細胞定位分析 利用PSORT 軟件，對NaNHX1 蛋白進行了亞細胞定位預測。結(jié)果表明，該蛋白位于質(zhì)膜（Plasma membrane）的可能性為60%，位于葉綠體類囊體膜（Chloroplast thylakoid membrane）的可能性為44.3%，位于高爾基體的可能性為40%，位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜（Endoplasmic reticulum membrane）的可能性為30%。該預測結(jié)果說明，NaNHX1 蛋白廣泛存在于花煙草細胞的膜系統(tǒng)中，可能參與了這些膜系統(tǒng)的物質(zhì)跨膜運輸。

2.2.5 磷酸化位點預測 利用在線軟件NetPhos3.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）對NaNHX蛋白進行了磷酸化位點預測。結(jié)果表明，NaNHX1蛋白可能含有34 個絲氨酸（Ser）位點，14 個蘇氨酸（Thr）位點，4 個酪氨酸（Tyr）位點。由此說明，NaNHX1 蛋白能被激酶磷酸化，從而參與花煙草的各種生理生化過程。

2.2.6 功能域與信號肽預測 通過CDD（https：// www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）網(wǎng)站，對NaNHX1 蛋白的保守功能域進行了預測。結(jié)果表明，NaNHX1 蛋白的第52-444 位氨基酸，存在Na+/ H+超家族反向轉(zhuǎn)運蛋白的典型保守結(jié)構(gòu)域NhaP2（Na+/H+Exchanger）（圖3），說明NaNHX1 蛋白可能行使著Na+/ H+反向轉(zhuǎn)運的功能。

通過SignalP 4.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）軟件，對NaNHX1 蛋白進行了信號肽預測，結(jié)果表明，該蛋白不含有信號肽。

圖3 NaNHX1 蛋白功能域的預測

2.2.7 二級結(jié)構(gòu)預測與三級結(jié)構(gòu)預測 利用SOPMA及Phyre2 在線軟件，對NaNHX1 蛋白的二級與三級結(jié)構(gòu)分別進行了預測。分析結(jié)果（圖4）表明，在二級結(jié)構(gòu)上，NaNHX1 蛋白主要由49.81%的α-螺旋（Alpha helix，265 個氨基酸參與）、33.27%的無規(guī)卷曲（Random coil，177 個氨基酸參與）、14.47%的延伸鏈（Extended strand，77 個氨基酸參與）以及2.44% β-轉(zhuǎn)角（Beta turn，13 個氨基酸參與）所構(gòu)成。同時，利用Phyre2 軟件，也預測了NaNHX1 蛋白的三級結(jié)構(gòu)。

圖4 NaNHX1 蛋白的二級結(jié)構(gòu)與三級結(jié)構(gòu)預測

2.2.8NaNHX1編碼蛋白的同源性分析 MEGA7 軟件，選用鄰位相連法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。從圖5 可以看出，NaNHX1與茄科植物的NHX基因親緣關(guān)系較近，而與其它植物的NHX基因親緣關(guān)系較遠。其中，同源性最高的為煙草屬的美花煙草（Nicotiana sylvestris，XP009789503.1）、茸毛煙草（Nicotiana tomentosiformis，XP009603482.1）以及番茄屬的番茄（Solanum lycoperisicum，XP001315563.1）的NHX基因；同源性最低的為擬南芥的NHX基因（AAM 08407.1）。

2.3 NaNHX1的組織表達分析

采用qRT-PCR 的方法，分析了NaNHX1在花煙草不同組織與器官中的表達量。結(jié)果（圖6）顯示，NaNHX1基因在花中表達量最高，莖中次之，根和葉中表達量較低。該結(jié)果說明，NaNHX1的表達具有組織特異性，廣泛參與了花煙草的生理生化過程，可能主要在花和莖中發(fā)揮作用。

圖5 NaNHX1 蛋白的同源性分析

圖6 NaNHX1 在花煙草不同組織器官中的表達分析

2.4 NaNHX1響應非生物脅迫的表達模式

對花煙草進行了5%PEG、高鹽（200 mmol/L NaCl）、低 鉀（10 μmol/L KCl）、低 溫（4℃）、ABA（1 μmol/L）和H2O2（10 mmol/L）等6 種非生物脅迫，并分析了在這6 種處理下NaNHX1分別在0 h、3 h、6 h、12h及24h的表達情況。

從圖7 可以看出，在這6 種非生物脅迫下，NaNHX1基因的表達呈現(xiàn)出不同表達的模式：（1）單峰升高型，如在低鉀、高鹽及H2O2脅迫下的表達；（2）單峰降低型，如在低溫脅迫下的表達；（3）雙峰型（先升高再降低再升高），如在PEG 及ABA脅迫下的表達。值得注意的是，NaNHX1響應PEG及ABA 脅迫表達的模式類似；在低鉀及高鹽下，NaNHX1的表達模式也較為一致，均在12h達到最高。本結(jié)果表明，NaNHX1可能廣泛參與了花煙草對非生物逆境脅迫的響應，尤其可能在干旱、高鹽、低鉀以及氧化脅迫中發(fā)揮重要作用。

圖7 NaNHX1 在非生物脅迫下的表達模式

3 討論

植物NHX家族基因，在植物的生長發(fā)育以及生物與非生物脅迫的應答反應中發(fā)揮著十分重要的作用［1-5］。其功能的行使，依靠其保守的NhaP2（Na+/H+Exchanger）結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域由大約393 個氨基酸所組成［16］。本研究克隆的NaNHX1基因所編碼的蛋白，也包含了一個NhaP2 結(jié)構(gòu)域（圖3）。所以，可以推測NaNHX1隸屬于植物的Na+/ H+超家族，能夠行使植物NHX家族基因所具有的功能。

NaNHX1 蛋白是一個疏水性較強的蛋白，在其氨基酸序列上，包含多個連續(xù)的疏水性區(qū)域。這些疏水性區(qū)域，能夠在植物的膜系統(tǒng)上形成跨膜結(jié)構(gòu)域，從而行使離子跨膜運輸?shù)墓δ堋？缒^(qū)預測的結(jié)果顯示，NaNHX1 蛋白具有10 個跨膜螺旋結(jié)構(gòu)，與NHX 類蛋白具有10-12 個跨膜區(qū)的特征一 致［4-5，16，20-21］。此外，NaNHX1 蛋白還包含了兩個不完全的跨膜區(qū)域，而該不完全跨膜區(qū)域被認為是Na+的結(jié)合位點［16，21-22］。此結(jié)果說明，NaNHX1 蛋白在跨膜結(jié)構(gòu)上具備了通透Na+的功能。

在正常生長的花煙草中，NaNHX1基因在根、莖、葉及花中均有表達，說明該基因的表達屬于組成型表達，這與擬南芥AtNHX1［23］、甜菜BvNHX1［24］和菊芋HtNHX1［25］的組成型表達特性相一致。同時，NaNHX1基因在花中的表達量最高，莖中次之，說明該基因的表達具有組織特異性，并可能主要在花與莖中發(fā)揮作用。在鹽脅迫下，杜梨PbNHX1［17］、紫花苜蓿MsNHX1［26］、馬藺IlNHX基因［27］、苦蕎FtNHX1［28］以及菊花Dnnhx1［29］的表達量均顯著增強。在本研究中，花煙草NaNHX1基因在200 mmol/L NaCl 脅迫12h后，其表達量達到最高。該結(jié)果表明，花煙草NaNHX1基因的表達對鹽脅迫有顯著的響應，該基因很大可能與花煙草的耐鹽性密切相關(guān)。

研究表明，植物的NHX基因還參與了植物對滲透脅迫的響應過程。例如，ABA 處理后，PbNHX1［17］、GhNHX1［30］及OsNHX1/OsNHX2/OsNHX5［31］的轉(zhuǎn)錄水平明顯上升。此外，蘋果MdNHX1［4］、PbNHX1［17］和擬南 芥AtNHX1［23］對PEG 脅迫有顯著的轉(zhuǎn)錄響應過程。本研究也得出了相同的結(jié)果，NaNHX1在5%PEG 及1 μmol/L ABA處理3h后，其表達量有明顯的上升。由此說明，NaNHX1還可能參與了花煙草對滲透脅迫的響應。

前人的研究表明，植物NHX 蛋白是一個Na+（K+）/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白，承擔Na+/K+的跨膜運 輸［1，3-5］。例如，AtNHX3是擬南芥低鉀脅迫響應中的關(guān)鍵組分［32］；擬南芥NHX1及NHX2承擔著向液泡中運輸鉀的功能，并在細胞膨壓維持及氣孔運動中發(fā)揮作用［33］。在本研究中，NaNHX1的表達在低鉀處理6h后急劇升高，并在12h達到最高，說明NaNHX1可能參與了花煙草響應外界低鉀的脅迫過程，同時也表明NaNHX1可能參與了鉀的跨膜運輸。

綜上所述，本研究所獲得的NaNHX1基因，具有與其他物種共同的功能屬性，如參與Na+與K+的運輸以及滲透脅迫等。同時，NaNHX1基因可能還具有不同于其他物種的自身獨特的功能。本研究還觀察到，NaNHX1的表達受4℃低溫及10 mmol/L H2O2的強烈誘導，這是以往NHX基因功能研究未見報道的。所以，本結(jié)果暗示，NaNHX1可能還參與了如氧化脅迫和低溫脅迫響應等非生物脅迫的應答，也說明了該基因功能的復雜與多樣性。因此，本研究的結(jié)果為花煙草NaNHX1基因功能研究以及響應非生物脅迫機制研究，提供了有價值的線索。

花煙草NaNHX1的克隆及表達模式分析，只是為花煙草NHX基因的功能研究提供了有益的借鑒，其在花煙草生長發(fā)育及非生物脅迫響應中的分子機制，有待更進一步的深入研究。

4 結(jié)論

花煙草NaNHX1基因所編碼的蛋白具有Na+/ H+超家族反向轉(zhuǎn)運蛋白的典型保守結(jié)構(gòu)域NhaP2（Na+/H+Exchanger），屬于植物的Na+/ H+超家族。該基因的表達具有組織特異性，響應非生物脅迫的誘導，并且對高鹽及低鉀有強烈的響應，能夠在花煙草離子脅迫響應中行使相應的功能。