原發(fā)性肝癌患者循環(huán)腫瘤細胞檢測及其與術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

劉 霞 方喜生 翁成蔭 伍 勇 毛海波 李寶秀 王麗娜 劉國龍

廣州市第一人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科(廣州 510180)

原發(fā)性肝癌(Primary liver cancer)是指發(fā)生在肝細胞或肝內(nèi)膽管細胞中的惡性腫瘤，是一種臨床上常見的難治性惡性腫瘤[1]。肝癌是全球第六大最常見的癌癥，也是全球第四大癌癥死亡原因，每年新發(fā)病人約有841 000例，其中有782 000人死亡。在我國慢性HBV感染和黃曲霉毒素暴露是肝癌發(fā)生的主要原因[2]。肝癌的臨床治療包括肝移植、手術(shù)切除、化療、放療、介入治療和免疫治療[3]。近年來，雖然肝癌的手術(shù)、射頻消融和化療取得了一定的進展，但由于肝癌的高復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率，其預(yù)后仍不理想[4]。目前臨床上還沒有一種很有效的手段能對肝癌的術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移進行比較準確的預(yù)測，腫瘤標志物、腹部CT、腹部MRI等傳統(tǒng)檢查仍是監(jiān)測術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的主要手段，但這些檢查結(jié)果的滯后性使其不能對術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移進行及時的預(yù)測；近年來，隨著生物醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)的不斷進步，CTC的檢測技術(shù)在不斷的提高，其在臨床應(yīng)用中的價值逐漸凸顯，細胞脫離原發(fā)腫瘤并通過血液流動被稱為循環(huán)腫瘤細胞(circulating tumor cell， CTC),早期發(fā)現(xiàn)和鑒定CTC對于監(jiān)測和預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生具有重要意義[5]。本研究通過比較原發(fā)性肝癌患者與肝臟良性病變患者外周血CTC表達情況，分析CTC對結(jié)腸癌的臨床價值，同時對行肝癌根治手術(shù)患者的外周血CTC進行動態(tài)監(jiān)測，并比較其與傳統(tǒng)血清腫瘤標志物甲胎蛋白(Alpha fetoprotein， AFP)對肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的預(yù)測價值。

1 資料與方法

1.1 研究對象

收集2014 年7 月—2016 年7月就診于我院的134例原發(fā)性肝癌患者，其中男62例，女72例；平均年齡(56.23±7.19)歲；所有原發(fā)性肝癌病例均為初診于我院的患者，均經(jīng)病理檢查證實為原發(fā)性肝癌。一般資料見表2。另選取72例同期在我院住院的肝臟良性病變患者做為對照，其中男38例、女34例，年齡(58.67±8.43)歲。在134例原發(fā)性肝癌患者中篩選出成功行肝癌根治術(shù)的患者，主要排除標準：無法完成根治性手術(shù)者；術(shù)中腹腔內(nèi)多發(fā)轉(zhuǎn)移或肝外轉(zhuǎn)移者；手術(shù)失敗者；合并其他臟器存在嚴重基礎(chǔ)疾病者；既往在我院就診前已經(jīng)過放化療或手術(shù)治療的患者；既往有其他系統(tǒng)危重疾病或惡性腫瘤病史患者；有任何不適合抽血的患者。對這些患者進行為期2年的隨訪，每位患者每3～4個月復(fù)查血清腫瘤標志物、胸、腹部CT等,如CT提示遠處臟器、局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時, 再行局部穿刺等檢查證實，將CT檢查發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移的時間定為轉(zhuǎn)移發(fā)生時間；入組所有肝臟良性病變患者均為未經(jīng)治療的初診患者。

1.2 研究方法

①標本采集：取所有患者的靜脈血10 mL分為兩份，一份2 mL，一份8 mL。2 mL靜脈血無抗凝劑處理，在25℃下離心處理7 min后進行常規(guī)血清腫瘤標志物檢測。另一份置入專用CellSave管，常溫運輸，嚴禁震蕩，且必須在4 d內(nèi)對該血液樣本進行CTC檢測。②血清AFP使用美國雅培AXSYM免疫化學(xué)發(fā)光分析儀和配套試劑檢測。循環(huán)腫瘤細胞檢測：利用外周血粒細胞表達CD45，即白細胞表面共同抗原，與磁珠結(jié)合后去除無關(guān)細胞，間接富集CTC。采用免疫熒光原位雜交技術(shù)(immunofluorescence in situ hybridizalion，imFISH)檢測CTC。CTC陽性判定標準：將CEP8(8號染色體探針)>兩個信號點，且CD45陰性、DAPI陽性的細胞定義為CTC。主要儀器：低速大容量離心機購自北京時代北利離心機有限公司，垂直混合儀購自寧波新芝生物公司，微型臺式真空泵購自其林貝爾公司，脫色搖床購自其林貝爾公司，熒光顯微鏡購自蔡司公司，雜交儀購自杭州奧盛公司，電熱恒溫鼓風干燥箱購自上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行分析。計數(shù)資料以[n(%)]表示，組間比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。用Kaplan-Meier方法繪制生存曲線比較術(shù)前術(shù)后CTC表達情況對術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移出現(xiàn)時間的影響，用受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線評估CTC、AFP對復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的診斷效能。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者CTC的檢查結(jié)果

原發(fā)性肝癌組與肝臟良性病變組患者血清中CTC水平比較，見表1。原發(fā)性肝癌組外周血CTC≥1、5、10的陽性率分別為74.34%、62.17%、25.36%，高于結(jié)腸良性病變組(P<0.001)。

表1肝癌組與肝臟良性病變組CTC檢測結(jié)果比較 n(%)

2.2 134例原發(fā)性肝癌患者臨床病理參數(shù)比較

AFP≥110.0 μg/L定為陽性，CTC≥5定位陽性。單因素分析結(jié)果顯示，CTC陽性與AFP陽性、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤結(jié)節(jié)多少有關(guān)，與年齡、性別、腫瘤直徑、分化程度、肝硬化有無、TNM分期無關(guān)，見表2。

表2134例肝癌患者臨床資料

2.3 術(shù)前和術(shù)后檢測CTC對原發(fā)性肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移關(guān)系

134例原發(fā)性肝癌患者成功手術(shù)者86例，除去失訪患者后共70例患者成功隨訪，將術(shù)前CTC≥5，術(shù)后CTC≥5列為第一組；術(shù)前CTC≥5，術(shù)后CTC<5列為第二組；術(shù)前CTC<5，術(shù)后CTC<5列為第三組；術(shù)前CTC<5，術(shù)后CTC≥5列為第四組；第一組患者成功隨訪19例，術(shù)后發(fā)生轉(zhuǎn)移17例；第二組患者成功隨訪35例，術(shù)后發(fā)生轉(zhuǎn)移20例；第三組患者成功隨訪12例，術(shù)后發(fā)生轉(zhuǎn)移3例；第四組患者成功隨訪4例，轉(zhuǎn)移1例。四組患者術(shù)后轉(zhuǎn)移的發(fā)生有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，術(shù)前CTC≥5，術(shù)后CTC≥5組患者術(shù)后發(fā)生轉(zhuǎn)移率高于術(shù)前CTC<5，術(shù)后CTC<5組患者，見圖1。

圖1 四組肝癌患者CTC表達情況與復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移出現(xiàn)時間比較(P=0.001)

2.4 CTC與AFP和原發(fā)性肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移關(guān)系

將AFP≥110.0 μg/L定為陽性，CTC≥5定位陽性，對成功手術(shù)者進行隨訪，分為CTC陽性組與AFP陽性組；CTC陽性組成功隨訪54例，術(shù)后發(fā)生轉(zhuǎn)移37例；AFP陽性組成功隨訪40例，術(shù)后發(fā)生轉(zhuǎn)移14例；兩組術(shù)后轉(zhuǎn)移發(fā)生時間有統(tǒng)計學(xué)意義，CTC陽性組術(shù)后發(fā)生轉(zhuǎn)移率高于AFP陽性，見圖2。

圖2 CTC陽性組與AFP陽性組肝癌患者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移出現(xiàn)時間比較(P=0.002)

2.5 以ROC曲線計算CTC、AFP在轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)預(yù)測的敏感度、特異度

CTC聯(lián)合AFP對術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移檢測的敏感度、特異度高于任意單獨一種指標檢測的敏感度、特異度，CTC聯(lián)合AFP檢測對于原發(fā)性肝癌有復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有更好的評估效能，見表3。

表3單獨與聯(lián)合檢測比較(%)

3 討 論

轉(zhuǎn)移是全世界癌癥患者死亡的主要原因，據(jù)世界衛(wèi)生組織估計，到2030年，每年因癌癥發(fā)生轉(zhuǎn)移而死亡的人數(shù)將超過2000萬人[6]。CTC在癌癥轉(zhuǎn)過程中起重要作用，了解它們在癌癥轉(zhuǎn)移所起的作用可能有助于更好的治療管理[7]。CTC來源于原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移灶，并含有與原發(fā)癌預(yù)后和治療相關(guān)的腫瘤分子特征的重要信息[8]。CTC不僅可用于研究腫瘤的生物學(xué)特性，還可克服傳統(tǒng)組織活檢的缺點，實時動態(tài)監(jiān)測腫瘤變化情況[9]。AFP是肝臟在胎兒發(fā)育過程中產(chǎn)生的一種主要血漿蛋白，在原發(fā)性肝癌患者中可升高，AFP水平升高與腫瘤復(fù)發(fā)和預(yù)后不良有關(guān)，也被證明是監(jiān)測肝癌治療反應(yīng)的有價值的工具[10]。

本研究對134例原發(fā)性癌患者和72例肝臟良性病變患者的外周血中CTC進行檢測，結(jié)果顯示原發(fā)性癌患者CTC檢出率(CTC ≥1 陽性率)為74.34%，高于肝臟良性病變患者，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)；同時對原發(fā)性癌患者不同疾病因素進行分析，結(jié)果顯示CTC陽性與AFP陽性、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤結(jié)節(jié)多少有關(guān)，與年齡、性別、腫瘤直徑、分化程度、肝硬化有無、TNM分期無關(guān)。

同時我們還對86例成功行肝癌根治術(shù)的患者進行了隨訪，除去失訪患者后共有70例患者成功隨訪，結(jié)果顯示術(shù)前CTC≥5，術(shù)后CTC≥5組患者術(shù)后發(fā)生轉(zhuǎn)移的概率(89.47%)高于其它三組患者(57.14%、25.00%、25.00%)。生存曲線顯示，術(shù)前CTC≥5，術(shù)后CTC≥5組患者，其術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的時間早于另外三組患者；進而說明，動態(tài)監(jiān)測CTC對原發(fā)性肝癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移具有一定的臨床應(yīng)用價值。

我們又進一步對比了CTC與AFP對原發(fā)性肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的預(yù)測價值，結(jié)果表明，CTC陽性組患者術(shù)后發(fā)生轉(zhuǎn)移的概率(68.52%)高于AFP陽性患者(35.00%)。生存曲線顯示，CTC陽性表達的患者中，其術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的時間早于AFP陽性表達的患者；進而說明，較傳統(tǒng)腫瘤標志物AFP，CTC具有更顯著的預(yù)測肝癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的價值，同時我們又采用ROC曲線評估了CTC、AFP及兩者聯(lián)合對術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的預(yù)測作用，結(jié)果顯示兩者聯(lián)合檢測其靈敏度、特異度較任意指標單獨監(jiān)測均升高。

綜上所述，本研究對術(shù)前術(shù)后CTC進行了動態(tài)監(jiān)測，結(jié)果表明，CTC在原發(fā)性肝癌患者中明顯表達，相對于AFP，CTC對原發(fā)性肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有更顯著的預(yù)測價值；兩者聯(lián)合監(jiān)測可提高術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移預(yù)測效果。本研究的不足之處在于只進行術(shù)前、術(shù)后兩個時間點進行CTC的檢測，若能對術(shù)后病人選取更多的時間點進行更加完善的CTC動態(tài)監(jiān)測，相信一定能更好的對術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移進行有效的預(yù)測，同時也只比較了其與AFP對原發(fā)性肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的優(yōu)勢，并未選取更多的腫瘤標志物，這是本研究存在的不足和應(yīng)該加強之處。