關(guān)于綠色熒光蛋白發(fā)色團激發(fā)態(tài)動力學(xué)行為的實驗設(shè)計與實踐

趙 莉， 鄭海霞， 展凱云， 劉 冰

（中國石油大學(xué)（華東）理學(xué)院，山東青島266580）

0 引 言

“創(chuàng)新是一個民族進步的靈魂，是一個國家興旺發(fā)達的不竭動力?！币虼耍囵B(yǎng)卓越的創(chuàng)新型人才是我國加快建設(shè)創(chuàng)新型國家、深入實施人才強國戰(zhàn)略的基礎(chǔ)和關(guān)鍵［1］。高等院校作為人才培養(yǎng)的重地，必須深化教學(xué)改革，才能適應(yīng)創(chuàng)新型人才培養(yǎng)的要求［2］。綜合性創(chuàng)新實驗是由教師引導(dǎo)學(xué)生進行自主學(xué)習(xí)的一種新型教學(xué)模式，有助于培養(yǎng)學(xué)生的知識運用能力、創(chuàng)新能力和動手實踐能力，激發(fā)學(xué)生的求知欲與探索欲［3-5］。

高精度的量化計算手段結(jié)合動力學(xué)模擬的方法，是現(xiàn)階段研究分子激發(fā)態(tài)動力學(xué)行為有效的理論手段。它是一門結(jié)合了經(jīng)典力學(xué)、量子力學(xué)、量子化學(xué)以及物理化學(xué)知識的綜合性技術(shù)。本項目依托于縱向科研項目，將最新的科研成果進行轉(zhuǎn)化，結(jié)合分子動力學(xué)以及非絕熱躍遷的研究熱點與前沿，利用高精度的量化計算手段結(jié)合面躍遷的非絕熱動力學(xué)模擬的方法，研究了綠色熒光蛋白發(fā)色團分子在獨立于熒光蛋白結(jié)構(gòu)時的激發(fā)態(tài)動力學(xué)行為。通過整個實驗過程，讓學(xué)生了解科學(xué)研究的過程，增強學(xué)生的科學(xué)素養(yǎng)、實踐能力、創(chuàng)新能力、競爭能力和合作意識。

1 實驗內(nèi)容設(shè)計依據(jù)

1962年，日本科學(xué)家下村修［6］從維多利亞多管水母細胞中發(fā)現(xiàn)了綠色熒光蛋白。1992年，Prasher等［7］將其克隆出來并投入到應(yīng)用中，這給分子生物學(xué)、藥學(xué)以及細胞生物學(xué)等領(lǐng)域帶來了革命性的突破。它可作為一種標(biāo)記蛋白無創(chuàng)性的植入活細胞中監(jiān)測基因表達、生物分子相互作用和蛋白質(zhì)定位等生物學(xué)過程［8］。而這些應(yīng)用主要來自于其內(nèi)部發(fā)色團高強度的熒光特性，熒光量子產(chǎn)率達到了0.8［9］?？茖W(xué)家們試圖從蛋白質(zhì)中分離出發(fā)色團分子進行應(yīng)用，卻發(fā)現(xiàn)發(fā)色團在獨立于熒光蛋白或在蛋白質(zhì)失活的情況下會發(fā)生熒光淬滅現(xiàn)象，熒光量子產(chǎn)率降至10-3［10］。這種完全不同的光學(xué)行為強調(diào)了發(fā)色團與包裹在外面的蛋白質(zhì)之間的聯(lián)合作用。目前已經(jīng)有大量的實驗和理論研究試圖揭示發(fā)色團在溶液和氣相中的熒光淬滅機理［11-13］。在這些研究的基礎(chǔ)上，科學(xué)家們認為一種由激發(fā)態(tài)分子扭轉(zhuǎn)觸發(fā)的內(nèi)轉(zhuǎn)換機制是導(dǎo)致熒光淬滅的關(guān)鍵原因［13］，分子將通過激發(fā)態(tài)與基態(tài)的錐形交叉點退回到基態(tài)。實驗中，人們發(fā)現(xiàn)該發(fā)色團分子的激發(fā)態(tài)壽命不隨溶液的濃度發(fā)生變化，表明分子在退激發(fā)時是一種節(jié)省空間的構(gòu)型變化，也就是單鍵和雙鍵同時扭轉(zhuǎn)的過程，稱為hula扭轉(zhuǎn)［14］。然而，通過時間分辨的熒光光譜實驗卻沒有發(fā)現(xiàn)雙鍵扭轉(zhuǎn)的反式（trans）產(chǎn)物，也就是沒有cis-trans對應(yīng)的雙鍵扭轉(zhuǎn)產(chǎn)生的異構(gòu)產(chǎn)物。由此，他們提出發(fā)色團分子是沿著單鍵扭轉(zhuǎn)進行退激發(fā)的［15-16］。由此可見，發(fā)色團分子在退激發(fā)時到底是沿著雙鍵、單鍵還是單雙鍵同時扭轉(zhuǎn)的機制依然不明確，而這對探究如何提高單獨的發(fā)色團分子的熒光特性至關(guān)重要。因此，采用了靜態(tài)的電子結(jié)構(gòu)計算結(jié)合動力學(xué)模擬的方法來研究綠色熒光蛋白發(fā)色團分子的激發(fā)態(tài)動力學(xué)行為。

2 實驗儀器

計算機、Molpro量化軟件包中的CASSCF模塊，Chemcraft及CYLview可視化軟件、自主開發(fā)的基于面跳躍的非絕熱動力學(xué)程序NAIMD-DICP、基態(tài)動力學(xué)模擬程序DFTB＋以及Origin繪圖軟件和Fortran編程軟件。

3 實驗教學(xué)設(shè)計

3.1 實驗預(yù)習(xí)

（1）實驗開始之前，教師將Molpro使用手冊、Origin繪圖軟件、Fortran編程軟件、Chemcraft及CYLview可視化軟件以及NAIMD-DICP和DFTB＋動力學(xué)模擬程序的使用說明資料發(fā)給學(xué)生，讓學(xué)生自主學(xué)習(xí)，了解量化計算軟件Molpro中CASSCF計算方法以及動力學(xué)程序的理論基礎(chǔ)。掌握輸入文件的構(gòu)建方法，CASSCF計算中活化空間的選擇方法、線性插值法LIIC的應(yīng)用和動力學(xué)模擬程序的計算流程、可視化軟件的使用、后期的數(shù)據(jù)處理如何利用Fortran自主編程以及繪圖程序Origin的使用。

（2）自主查閱文獻了解分子在激發(fā)態(tài)的幾種退激發(fā)過程，根據(jù)雅布隆斯基電子躍遷圖掌握非絕熱躍遷的理論基礎(chǔ)以及錐形交叉點的相關(guān)知識。

（3）教師提前準(zhǔn)備關(guān)于綠色熒光蛋白的激發(fā)態(tài)動力學(xué)理論研究的相關(guān)文獻發(fā)給學(xué)生，讓學(xué)生提前閱讀，在此基礎(chǔ)上學(xué)生自主查閱相關(guān)文獻，找出研究空白，并了解文獻中的理論分析方法。

（4）學(xué)生根據(jù)閱讀自主查詢的文獻嘗試設(shè)計實驗。

3.2 實驗操作

3.2.1 模型構(gòu)建

在進行模擬計算之前，構(gòu)建合適的計算模型至關(guān)重要。從維多利亞多管水母細胞中分離出來的野生型綠色熒光蛋白分子是由238個氨基酸殘基組成，其晶體結(jié)構(gòu)是11個β-折疊組成的桶狀結(jié)構(gòu)，在桶中央有一個α-螺旋，發(fā)色團分子就在α-螺旋上，其結(jié)構(gòu)如圖1所示。

考慮到綠色熒光蛋白的強熒光就來自于α-螺旋上的發(fā)色團分子，在野生綠色熒光蛋白中它是以陰離子的形式存在，因此在綜合考慮實際模型、計算效率、計算精度等因素后，選擇了一種廣泛應(yīng)用的結(jié)構(gòu)對羥基芐基咪唑啉酮陰離子（HBI-）作為計算模型（見圖2），該模型是把兩個甲基取代基用兩個氫原子取代，這種簡化可以保證在不改變其性質(zhì)的前提下降低計算成本。這種方法已經(jīng)被很多理論計算文章使用過［13，17］。HBI-是順式結(jié)構(gòu)，標(biāo)記為cis-1。由于重點在于研究發(fā)色團分子到底是單鍵還是雙鍵扭轉(zhuǎn)，為了區(qū)分，利用如圖2所示的二面角進行標(biāo)記，單鍵扭轉(zhuǎn)為φ，雙鍵扭轉(zhuǎn)為τ。根據(jù)組合，一共可以有4種異構(gòu)體，如圖3所示。

圖1 綠色熒光蛋白GFP的四級結(jié)構(gòu)圖

圖2 綠色熒光蛋白發(fā)色團分子的計算模型

圖3 綠色熒光蛋白發(fā)色團分子的4種異構(gòu)體

3.2.2 計算方法

實驗中發(fā)現(xiàn)更高能級的電子激發(fā)態(tài)對發(fā)色團分子的退激發(fā)行為影響甚微，因此在計算過程中只考慮了基態(tài)（S0）和第一電子激發(fā)態(tài)（S1）［18-19］。所有的電子結(jié)構(gòu)計算都采用Molpro軟件中的CASSCF方法。CASSCF計算中有兩個具有相同比重的電子態(tài)參與態(tài)平均。值得一提的是，CASSCF的計算方法依賴于活化空間的選擇，因此選擇合適的活化空間至關(guān)重要。一般情況下，選擇的活化空間越大，計算結(jié)果越準(zhǔn)確，但是計算耗時也越長。所以在進行靜態(tài)電子結(jié)構(gòu)計算時，優(yōu)先選擇大的活化空間和基組以保障計算的準(zhǔn)確度。但是對于動態(tài)的動力學(xué)模擬過程，選擇大的活化空間和基組會消耗大量的計算機時，因此還需要在保證計算精度的前提下，選擇計算耗時更短的小活化空間。為此，對比了不同活化空間（14e，12o）、（10e，8o）以及（6e，5o）和不同基組下（6-31G*和6-31G）優(yōu)化的穩(wěn)定構(gòu)型和錐形交叉點的結(jié)構(gòu)參數(shù)，如表1、2所示。通過數(shù)據(jù)可見，（6e，5o）的活化空間搭配6-31G的基組優(yōu)化得到的構(gòu)型參數(shù)與大活化空間（14e，12o）和6-31G*基組得到的相差不大。另外，由于分子的激發(fā)態(tài)行為取決于該分子激發(fā)態(tài)和基態(tài)勢能面的拓撲結(jié)構(gòu)，為了進一步確認（6e，5o）／6-31G計算的準(zhǔn)確性，利用線性插值法LIIC得到了Franck-Condon點與錐形交叉點間的勢能曲線，如圖4所示。二者的拓撲結(jié)構(gòu)一致，說明用（6e，5o）／6-31G進行動力學(xué)模擬得到的結(jié)果是可信的。

表1 在不同的計算水平下優(yōu)化得到的HBI-分子在不同電子態(tài)的重要結(jié)構(gòu)參數(shù)（鍵長單位為10-1pm，鍵角和二面角的單位為（°））

表2 在CASSCF（6e，5o）／6-31G，CASSCF（10e，8o）／6-31G*和CASSCF（14e，12o）／6-31G*計算水平下優(yōu)化得到的4 個錐形交叉點的主要構(gòu)型參數(shù)（鍵長單位為10-1pm，鍵角和二面角的單位為（°））

圖4 在不同計算水平下利用線性插值法得到的基態(tài)和激發(fā)態(tài)的勢能曲線

非絕熱動力學(xué)部分采用的是自主開發(fā)的基于Zhu等［20］電子躍遷理論的動力學(xué)程序，具體的計算細節(jié)需要學(xué)生在實驗預(yù)習(xí)階段掌握。軌線的核運動方程采用Velocity-Verlet［21］算法進行數(shù)值積分，步長設(shè)為0.5 fs。由于在錐形交叉點處構(gòu)型變化信息更加重要，因此將步長減少至0.1 fs。每一步對應(yīng)的電子態(tài)能量，梯度以及電子態(tài)耦合系數(shù)都是通過調(diào)用外接的Molpro（http：／／www.molpronet）程序包進行。在運行動力學(xué)模擬之前，需要選取合適的初始坐標(biāo)和速度。初始坐標(biāo)和速度的選擇方法有很多種，如基態(tài)的動力學(xué)模擬、玻爾茲曼分布、Winger分布、高斯分布等。先選擇基于DFTB＋的基態(tài)動力學(xué)模擬方法，在室溫下計算500 ps，在分子達到平衡后，再在動力學(xué)結(jié)果中隨機地選取構(gòu)型和速度作為初始條件。計算的軌線數(shù)量由學(xué)生自主決定，一般數(shù)量越多，統(tǒng)計意義越明顯。但一般認為計算結(jié)果達到收斂即可，經(jīng)過計算30條軌線可滿足要求。

4 結(jié)果與討論

4.1 靜態(tài)電子結(jié)構(gòu)計算分析

靜態(tài)的電子結(jié)構(gòu)計算，采用的是SA2-CASSCF（14e，12o）方法來優(yōu)化基態(tài)、第一激發(fā)態(tài)的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)以及兩個電子態(tài)之間的錐形交叉點。相應(yīng)的結(jié)構(gòu)參數(shù)已分別在表1、2中展示，錐形交叉點的構(gòu)型如圖5所示。如上所述，錐形交叉點作為分子從激發(fā)態(tài)到基態(tài)的反應(yīng)通道，那么優(yōu)化的這4個錐形交叉點是否全部參與到退激發(fā)過程中呢？為此，還需要接下來的動力學(xué)模擬來確定上述錐形交叉點的作用。

圖5 在SA2-CASSCF（14e，12o）／6-31G*水平下優(yōu)化得到的4個錐形交叉點

4.2 動力學(xué)模擬結(jié)果分析

對31條軌線進行分析，每條軌線以目標(biāo)分子的弛豫過程從Franck-Condon點開始，最終生成穩(wěn)定的基態(tài)產(chǎn)物為準(zhǔn)。首先，統(tǒng)計了HBI-分子每條軌線的躍遷時間，并根據(jù)此畫出基態(tài)和激發(fā)態(tài)隨時間的布居數(shù)，如圖6所示。這些分子的退激發(fā)時間從0.3 ps持續(xù)到1.4 ps，且主要集中在0.7～1.1 ps之間。平均躍遷時間為807.3 fs，這與實驗上得到的激發(fā)態(tài)壽命吻合［22］，再一次證明了所用模擬方法是可靠的。

圖6 基態(tài)和激發(fā)態(tài)隨時間的布居曲線圖

圖7中總結(jié)了各條軌線的躍遷點與錐形交叉點之間的關(guān)系，可見，所有的躍遷點都圍繞在4個錐形交叉點周圍，說明這4個錐形交叉點都參與了發(fā)色團分子的退激發(fā)過程。值得一提的是，雖然這些躍遷點都圍繞在錐形交叉點附近，但是仍然有一定的分布范圍，表明分子在退激發(fā)時只要在錐形交叉區(qū)域內(nèi)滿足躍遷條件都可以發(fā)生躍遷。另外，所有的軌線最后只產(chǎn)生成了順式的產(chǎn)物，并沒有發(fā)現(xiàn)反式產(chǎn)物。也就是說由cis-trans對應(yīng)的雙鍵扭轉(zhuǎn)在整個躍遷過程中并不存在，只有單鍵扭轉(zhuǎn)產(chǎn)物產(chǎn)生。從優(yōu)化得到的錐形交叉點可以看出，這4個錐形交叉點既包含單鍵扭轉(zhuǎn)的過程，也包含雙鍵的扭轉(zhuǎn)。那么，為什么最終沒有生成因雙鍵扭轉(zhuǎn)而產(chǎn)生的trans產(chǎn)物呢？為了解決這個問題，又掃描了分子在基態(tài)和激發(fā)態(tài)隨CCCN和CCCC變化的二維勢能面，如圖8所示。可以發(fā)現(xiàn)，分子在被躍遷至激發(fā)態(tài)后，可以有兩條路線退激發(fā)至基態(tài)，如圖8中左箭頭所示。到達基態(tài)后分子恰好落到勢能面的“山脊”上，在弛豫過程中可無勢壘的產(chǎn)生cis-1和cis-2。但是在生成trans產(chǎn)物的路徑上存在勢壘，因此阻止了trans產(chǎn)物的生成。

4.3 退激發(fā)機理總結(jié)

綜上所述，總結(jié)了綠色熒光蛋白發(fā)色團的退激發(fā)機理。當(dāng)分子被垂直激發(fā)到第1激發(fā)態(tài)后，會通過單雙鍵協(xié)同扭轉(zhuǎn)的形式（hula扭轉(zhuǎn)）到達錐形交叉點附近，這可以解釋實驗中發(fā)現(xiàn)的發(fā)色團分子的激發(fā)態(tài)壽命與溶液黏度無關(guān)的現(xiàn)象。當(dāng)分子通過錐形交叉點退激發(fā)至基態(tài)后，單鍵繼續(xù)扭轉(zhuǎn)生成新的順式結(jié)構(gòu)（cis-2）或反向扭轉(zhuǎn)生成之前的反應(yīng)物（cis-1）。但是此時的雙鍵只會發(fā)生反向扭轉(zhuǎn)，因此不會生成反式（trans）結(jié)構(gòu)的產(chǎn)物，這與實驗中只發(fā)現(xiàn)順式產(chǎn)物的結(jié)果一致。

圖7 以CCCC（縱坐標(biāo)）和CCCN（橫坐標(biāo)）為變量做S1到S0躍遷點以及最終產(chǎn)物的散點圖

圖8 以CCCC和CCCN二面角為變量掃描得到的S1和S0態(tài)的勢能面［23］。上面的星標(biāo)分別表示激發(fā)態(tài)和基態(tài)的最穩(wěn)定構(gòu)型，箭頭表示退激發(fā)反應(yīng)進行的方向

4.4 實驗內(nèi)容拓展

本實驗屬于研究型實驗，以野生綠色熒光蛋白的發(fā)色團分子為計算模型，采用高精度的量化計算手段以及非絕熱動力學(xué)模擬的方法進行模擬計算，綜合模擬結(jié)果進行理論分析揭示了綠色熒光蛋白發(fā)色團分子在獨立于熒光蛋白之后發(fā)生熒光淬滅的內(nèi)在機理。學(xué)生在教師的指導(dǎo)下完成了整個模擬過程，從科研選題、量子化學(xué)基礎(chǔ)知識、計算模型的建立以及后期的數(shù)據(jù)分析等基本方法，激勵學(xué)生由機械式學(xué)習(xí)到自主探究型學(xué)習(xí)，培養(yǎng)他們交叉學(xué)科知識的綜合運用能力?？紤]到課時量和不同學(xué)生的接受程度，對實驗內(nèi)容進行了充實與拓展，如圖9所示。

首先是研究內(nèi)容的拓展，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展以及現(xiàn)實需求的增加，不同顏色的熒光蛋白已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)或通過基因克隆與變異技術(shù)發(fā)展出來。但是，與綠色熒光蛋白不同，不同顏色的熒光蛋白具有不同的激發(fā)態(tài)行為。因此，在本工作的基礎(chǔ)上可以拓展以下的實驗內(nèi)容：

圖9 試驗拓展內(nèi)容

（1）研究藍色熒光蛋白的發(fā)色團在激發(fā)態(tài)的動力學(xué)行為，并與綠色熒光蛋白進行對比，分析不同的分子結(jié)構(gòu)對激發(fā)態(tài)行為的影響。

（2）黃色熒光蛋白的激發(fā)態(tài)行為更加復(fù)雜，與藍色、綠色熒光蛋白只有第1激發(fā)態(tài)參與不同，黃色熒光蛋白的激發(fā)態(tài)行為S2態(tài)也有參與，且它的熒光量子產(chǎn)率與激發(fā)波長有關(guān)，因此在計算時需要考慮3個電子態(tài)之間的耦合與躍遷，鼓勵有能力的學(xué)生對現(xiàn)有的動力學(xué)模擬程序進行改善，使其能夠處理3個電子態(tài)的躍遷行為。

其次是研究內(nèi)容的深化，目前研究的綠色熒光蛋白分子是在氣相環(huán)境中，沒有考慮液相環(huán)境的影響。因此，在本工作的基礎(chǔ)上，還可以考慮溶劑化效應(yīng)，探索在不同溶液環(huán)境中綠色熒光蛋白發(fā)色團分子的激發(fā)態(tài)動力學(xué)行為，分析分子間氫鍵對其動力學(xué)行為的影響機制。拓展的內(nèi)容工作量較大，教師可根據(jù)教學(xué)時長靈活地選取部分內(nèi)容進行課堂教學(xué)，也可以作為有興趣學(xué)生的創(chuàng)新研究內(nèi)容。

4.5 撰寫實驗報告

實驗課后，學(xué)生需要對計算模擬過程進行概括總結(jié)，分析靜態(tài)的電子結(jié)構(gòu)計算與動力學(xué)模擬的結(jié)果，并按照科研論文的格式撰寫實驗報告，分析總結(jié)計算過程中所遇到的問題及處理方式。對于進行實驗內(nèi)容擴展的學(xué)生研究報告，將由教師協(xié)助修改并向雜志社進行投稿。

5 結(jié) 語

本設(shè)計性實驗通過高精度的電子結(jié)構(gòu)計算和非絕熱動力學(xué)模擬的手段，研究了綠色熒光蛋白發(fā)色團分子在被獨立于熒光蛋白后發(fā)生熒光淬滅的內(nèi)在機理。與之前的理論報道不同，提出了綠色熒光蛋白發(fā)色團分子在退激發(fā)時是以單鍵扭轉(zhuǎn)為主，雙鍵扭轉(zhuǎn)為輔的退激發(fā)機理。

該設(shè)計性實驗包含的理論知識復(fù)雜，涉及到數(shù)學(xué)、物理、化學(xué)、計算機編程等多個學(xué)科的交叉運用，有助于培養(yǎng)學(xué)生的科研創(chuàng)新能力，知識綜合運用能力以及獨立思考解決問題的能力。到目前為止，已經(jīng)取得了很好的成績，有6位本科生通過查閱文獻，自己擬定題目并獲批校級大學(xué)生創(chuàng)新項目，有4位已在雜志上公開發(fā)表科研論文。對于想繼續(xù)讀研究生的學(xué)生，可大大縮短他們?nèi)谌肟蒲袌F隊的周期。