“基因工程學”教學中基因擴增克隆及表達實驗設計

賈立軍

（延邊大學農學院，吉林延吉133002）

0 引 言

基因工程學是生命科學領域的核心課程，其內容包括基因操作技術原理、基因克隆的酶學基礎、質粒載體、基因的分離鑒定與表達等［1-2］。實驗課程設計是對理論課程學習的實踐操作，目的是使學生能夠真正做到理論聯系實際，掌握基因工程的基本實驗技能，進而培養學生的創新思維、創新意識以及實踐動手能力［3-5］。

新孢子蟲是寄生于多種哺乳動物細胞內的一種原蟲，是引起牛流產、死胎及神經癥狀的主要病原體，是危害養牛業健康發展的主要因素［6-7］。NcAMA1基因是新孢子蟲由微線分泌的典型跨膜蛋白基因，在侵染宿主細胞的過程中具有介導黏附和入侵宿主細胞的作用，是新孢子蟲目前研究的熱點基因之一［8］。基因工程學實驗教學中以新孢子蟲為實驗材料，以NcAMA1基因為研究對象，對學生進行基因工程學實驗技能訓練。學生在老師的指導和查閱相關文獻的基礎上，設計實驗技術路線，通過具體的實驗操作和科研訓練，學習并掌握了實驗技能，從而激發了學生創新性探索精神，培養了學生獨立分析和解決問題的能力，促進了學生理論知識與實驗技能的相互融合［9-11］。

1 實驗原理與實驗材料

1.1 實驗教學設計原理與技術路線

以新孢子蟲為實驗材料，提取新孢子蟲基因組DNA，設計NcAMA1基因特異性引物，以新孢子蟲基因組DNA為模板，PCR擴增NcAMA1基因，擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，將鑒定正確的PCR產物回收，連接pMD-18T Sample vector克隆載體，將PCR鑒定和酶切鑒定正確的克隆質粒回收目的基因，再連接pVAX1真核表達載體，將PCR鑒定和酶切鑒定正確的真核表達質粒轉染Vero細胞，最后應用間接免疫熒光（IFAT）檢測NcAMA1基因在Vero細胞中表達。具體實驗技術路線如圖1所示。

圖1 NcAMA1基因擴增、克隆及真核表達實驗技術路線

1.2 實驗教學材料

新孢子蟲和Vero細胞由學校預防獸醫學實驗室保存、培養；基因組DNA提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、質粒DNA提取試劑盒、限制性內切酶EcoR I、BamH I，ExTaq、T4 DNA 連接酶、DL15000 Marker、DL2000 Marker、Lipofectamine 2000等均購自寶生物工程（大連）有限公司；DH5α感受態細胞由預防獸醫學實驗室制備；pMD-18T Sample vector克隆載體、pVAX1真核表達載體由預防獸醫學實驗室保存；熒光素（FITC）標記的抗牛IgG購自美國Sigma公司，牛新孢子蟲陽性血清由預防獸醫學實驗室制備；DMEM培養基、犢牛血清、胰蛋白酶、雙抗、細胞培養瓶購自哈爾濱東山科技有限公司；其他常規試劑均為進口或國產分析純級。

1.3 實驗引物設計與合成

根據GenBank上登錄的新孢子蟲（登錄號：AB265823.1）NcAMA1基因序列開放閱讀框，應用Oligo 6.0軟件設計引物，酶切位點EcoR I和BamH I（引物序列中下劃線標記）。引物序列：上游引物P1：5’-CCGGAATTCGCCACCATGAGCAAAATCAAGGCGA GTA-3’；下游引物P2：5’-CTAGGGATCCTTAAGAATC CGAAACCAGGCA-3’。由上海英駿生物技術公司合成。

1.4 實驗儀器與試劑

儀器：PCR 擴增儀（德國eppendorf）、FluorChem FC2 System成像系統（美國UVP）、二氧化碳培養箱（日本三洋）、WD-2101A型電泳系統（北京六一儀器廠）；臺式高速離心機（西格瑪公司）；ES-315高壓滅菌鍋（TOMY）；TE2000倒置熒光顯微鏡（日本Nikon公司）。

試劑：細胞培養所用試劑（PBS緩沖液）；瓊脂糖凝膠電泳所需溶液（0.5 mol／L EDTA、50 × TAE 電泳緩沖液、10 mg／mL EB）；基因克隆、酶切所需試劑（50%丙三醇溶液、LB液體培養基、LB固體培養基）；IFAT試驗所用試劑（PBS溶液、固定液、血清稀釋液、熒光二抗稀釋液、磷酸鹽緩沖甘油、洗滌液），所用試劑溶液均需實驗前配制完成。

2 實驗步驟

2.1 基因組DNA的提取

按照常規細胞與蟲體培養方法復蘇、培養Vero細胞和新孢子蟲，按照基因組DNA提取試劑盒說明書提取新孢子蟲基因組DNA。

2.2 目的基因PCR擴增

以提取的新孢子蟲基因組DNA為模板，應用引物P1和P2進行PCR擴增。PCR擴增體系為：模板DNA 1.00 μL，dNTP 2.50 μL，Buffer 2.50 μL，引物P1 1.00 μL，引物P2 1.00 μL，Ex Taq 0.25 μL，ddH20 16.75 μL。總體系為25 μL。PCR反應條件如圖2所示，30個循環。PCR產物經10 g／L瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，應用DNA凝膠回收試劑盒回收、純化PCR產物，于-20℃儲存備用。

圖2 PCR反應條件

2.3 目的基因克隆與鑒定

將回收的目的基因NcAMA1與克隆載體pMD18-T Simple Vector連接4℃過夜，連接體系為：目的基因NcAMA1 4 μL，pMD18-T Simple Vector 1 μL，Solution 5 μL。連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，含Amp固體LB平板挑選陽性克隆，搖菌過夜后，提取質粒DNA進行PCR鑒定和雙酶切鑒定。PCR鑒定方法按照PCR擴增體系和圖2進行；EcoR I、BamH I雙酶切反應體系為：pMD18T-NcAMA1 10 μL，Buffer（10×H）2 μL，EcoRⅠ 1 μL，BamHⅠ 1 μL，ddH2O 6 μL。

2.4 真核表達質粒的構建與鑒定

應用EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切重組克隆質粒pMD18T-NcAMA1和真核表達載體pVAX1。分別回收目的基因NcAMA1和真核表達載體pVAX線性片段，應用T4 DNA連接酶連接，反應體系為：NcAMA1 10 μL，pVAX 線性DNA 片段3 μL，10 ×Ligation buffer 2 μL，T4 DNA 連接酶1 μL，ddH2O 4 μL。連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，含Amp固體LB平板挑選陽性克隆，搖菌過夜后，提取質粒DNA進行PCR鑒定和雙酶切鑒定。PCR鑒定方法按照PCR擴增體系和圖2進行；EcoR I、BamH I雙酶切反應體系為：pMD18T-NcAMA1 10 μL，Buffer（10×H）2 μL，EcoRⅠ1 μL，BamHⅠ 1 μL，ddH2O 6 μL。將鑒定正確真核表達質粒命名為pVAX-NcAMA1。

2.5 重組真核質粒轉染Vero細胞

轉染前準備：將37℃、5%CO2細胞培養瓶培養的Vero細胞傳入24孔細胞培養板中，培養細胞單層生長至板底的80%左右，吸棄DMEM培養液，用無Ca2＋、Mg2＋的PBS 將細胞洗滌3 遍。同時，將6 μL pVAX-NcAMA1加入到94 μL無血清和抗生素DMEM的1.5 mL 離心管中；將3 μL Lipofectamine 2000 加入到97 μL無血清和抗生素DMEM的1.5 mL離心管中。室溫靜置5 min后，將兩個離心管中液體混合到一個1.5 mL離心管中，混勻，室溫靜置30 min。

細胞轉染：將1.5 mL離心管中混合液加入已洗滌3遍的24孔板Vero細胞中，然后每孔加入500 μL無血清和抗生素DMEM。于37℃、5%CO2培養箱中培養4～6 h后，吸棄培養液，每孔加入2 mL含20%血清的DMEM繼續培養48 h，期間更換一次培養液。

2.6 間接免疫熒光檢測（IFAT）

pVAX-NcAMA1轉染Vero細胞48 h后，用PBS洗滌Vero細胞3次→10%冷丙酮固定10 min→PBS洗滌3次→加入一抗（1∶200稀釋牛新孢子蟲陽性血清）→37℃孵育1 h→PBS洗滌3次→加入二抗（1∶2 000稀釋FITC標記抗牛IgG）→37℃孵育1 h→PBS洗滌3次→倒置熒光顯微鏡下觀察并照相。

3 實驗結果與分析

3.1 目的基因PCR擴增與克隆

以新孢子蟲基因組DNA為模板，應用引物P1和P2擴增，得到如圖3所示大小為679 bp NcAMA1基因片段，說明PCR擴增目的基因實驗結果正確。重組克隆質粒pMD18T-NcAMA1經PCR鑒定和雙酶切鑒定，獲得如圖4所示的2 692 bp和679 bp片段，說明目的基因克隆實驗結果正確。

圖3 NcAMA1基因的PCR擴增

圖4 pMD18T-NcAMA1的雙酶切鑒定結果

3.2 目的基因真核表達質粒的構建及真核表達

對構建的pVAX-NcAMA1重組真核表達質粒進行PCR鑒定和雙酶切鑒定，PCR擴增目的片段大小為679 bp，說明PCR鑒定實驗結果正確。BamHⅠ與EcoRⅠ雙酶切獲得679 bp目的基因片段和2 999 bp真核表達載體片段，說明pVAX-NcAMA1真核表達質粒構建正確。pVAX-NcAMA1質粒轉染Vero細胞后，IFAT檢測，如圖5所示，Vero細胞中出現綠色熒光，說明NcAMA1基因在Vero細胞中獲得瞬時表達。

圖5 IFAT檢測NcAMA1基因在Vero中表達（400×）

4 結 語

基因工程學課程是一門承上啟下的尖端課程，也是連接本科生和研究生之間的紐帶課程［12］。基因工程學實驗課的學習直接關系到本科生的畢業論文設計、大學生創新創業訓練項目立項結題以及研究生課題試驗，生物技術專業本科生80%以上的畢業論文設計和大學生創新創業訓練項目均涉及到基因工程學實驗內容［13-14］；而研究生課題試驗也需要掌握PCR擴增、基因克隆表達等最基本實驗技術。因此，學生認真學習并掌握基因工程學的實驗技能至關重要［15-16］。

基因工程學實驗教學的整個實驗過程包括基因組DNA的提取、目的基因PCR擴增、目的基因與克隆載體連接、重組克隆質粒構建、克隆質粒PCR鑒定和酶切鑒定、目的基因與表達載體連接、重組表達質粒構建、表達質粒PCR鑒定和酶切鑒定、目的基因轉染真核細胞表達蛋白、以及IFAT檢測等10個連續實驗內容的貫穿。讓學生真正實現了基因工程學課程全部理論知識應用于生產實踐的目標。整個實驗過程既包括基因組學、生物化學、物理學及計算機軟件知識，也包括免疫學、細胞生物學及蛋白質學等知識，讓學生領會到了不同學科知識的融會貫通；也讓學生學習到了PCR擴增、蛋白質表達、免疫學檢測等技術方法。

在老師的指導和學生的共同努力下，學生通過自主學習，獨立完成了NcAMA1基因的克隆表達，并應用免疫學方法對表達蛋白進行了檢測。通過對整個實驗的實踐操作，學生可以獨自完成對已知基因的PCR擴增、克隆及表達的實驗驗證，也可以對未知基因的功能進行探索研究。從而激發了學生自主探究的興趣，為創新思維的形成打下了良好基礎。從理論聯系實際，再到實踐操作，進而對科研的探索，最終培養了學生認識問題、分析問題、解決問題的能力。