蛋白質免疫印跡技術在本科實驗教學中的應用

李 欣， 趙玉紅， 石建黨， 趙立青， 李小菊， 張偉英

（南開大學生命科學學院生物國家級實驗教學示范中心，天津300071）

0 引 言

蛋白質免疫印跡（Westernblotting或Immunoblotting）技術是通過免疫學手段，即利用抗原抗體特異性結合來檢測固定在支撐膜上的蛋白質，從而對靶蛋白進行定性和半定量分析的一項重要實驗技術［1-2］。該技術將電泳的高分辨率和免疫反應的高特異性結合在一起，有利于在復雜樣品中對靶蛋白進行檢測和鑒別，進而獲得相應細胞或組織中靶蛋白的表達水平等相關信息，是分子生物學、生物化學和免疫遺傳學等諸多研究領域中常用的實驗方法［3-4］。

基于蛋白質免疫印跡技術的重要性和實用性，我校生物實驗教學中心分子生物學課程組積極嘗試將其引入本科實驗教學，設置了“免疫印跡法檢測目的基因在原核細胞中的表達”這一綜合性實驗。該實驗首先利用SDS-PAGE將菌體樣品中的蛋白分離，再經過電泳轉印將蛋白轉移至固相支撐膜上，通過抗體雜交特異性的檢測菌體中目的蛋白的表達情況。該實驗的設置旨在讓學生能夠緊跟學科發展，充分理解并掌握免疫印跡法這一科研領域常用技術手段，并在教學實踐中培養學生嚴謹的科學思維和良好的科學素養，以便更好地與未來發展接軌［5-6］。

1 主要實驗儀器

Bio-Rad垂直電泳裝置，Bio-Rad Mini Trans-Blot轉印槽，Bio-Rad Mini Trans-Blot SD半干轉印槽，Bio-Rad PowerPac HC高電流電泳儀，Eppendorf 5418離心機，金屬浴，恒溫振蕩培養箱，GeneSys Chemi：XR5凝膠成像系統，磁力攪拌器，搖床等。

2 主要實驗材料與試劑

分別轉化有pGEX-4T-2和pGEX-4T-2／GAPDH質粒的大腸桿菌DH5α，30%丙烯酰胺凝膠貯液，分離膠緩沖液（1.5 mol／L Tris-HCl，pH8.8），濃縮膠緩沖液（0.5 mol／L Tris-HCl，pH6.8），10%SDS，10%AP，TEMED，1×電極緩沖液，2×SDS-PAGE上樣緩沖液，預染Marker，1×PBS溶液，電轉移緩沖液（濕轉／半干轉），100%甲醇，PVDF 膜，Whatman 3MM 濾紙，PBST，封閉液（5%脫脂奶粉），鼠源抗GST抗體，辣根過氧化物酶（Horseradish Peroxidase，HRP）偶聯羊抗鼠IgG，ECL化學發光試劑盒等。

3 實驗方法

3.1 大腸桿菌的誘導培養

（1）菌種培養。將含pGEX-4T-2空載體和pGEX-4T-2／GAPDH重組質粒的大腸桿菌DH5α分別接種于10 mL含有80 μg／mL氨芐青霉素的LB培養基中，37℃，200 r／min 振蕩培養。

（2）誘導培養。至OD600達0.4～0.6 時，分裝菌液至細菌培養管中，每管4 mL，兩種菌液各分2管，其中1管作為對照，不加IPTG誘導，另外1管加入IPTG至終濃度1 mol／L，20 ℃，200 r／min 振蕩培養過夜。

3.2 樣品的制備

（1）收集菌體。在1.5 mL離心管中加入100 μL菌液，12 000 r／min 離心1 min，棄去上清，4 份菌液樣品收集方法相同。

（2）菌體裂解。在4份菌體沉淀中分別加入100 μL PBS溶液，充分混勻后再加入等量2×SDS-PAGE上樣緩沖液，混勻后金屬浴上100℃加熱20 min，并且每隔幾min輕彈盛裝樣品的離心管底部，保證菌體裂解充分。

（3）獲得上樣樣品。菌體裂解液14 000 r／min離心5 min，上清用于上樣。

3.3 SDS-PAGE

（1）制膠。配制12%分離膠和5%濃縮膠。

（2）上樣。預染Marker 3 μL，樣品8 μL。

（3）電泳。樣品在濃縮膠時電壓80 V，在分離膠時120 V。

3.4 電泳轉印

（1）根據Marker條帶將凝膠切成理想大小，剪好同等大小的濾紙和PVDF膜。

（2）將PVDF膜放入100%甲醇中浸泡1～2 min。

（3）將凝膠、濾紙和PVDF膜放入電轉移緩沖液中平衡。

（4）在Bio-Rad Mini Trans-Blot轉印槽或Bio-Rad Mini Trans-Blot SD半干轉印槽中組裝“三明治”結構，轉印槽連接電泳儀，前者4℃ 100 V恒壓轉印1 h，后者10 V轉印30 min。

3.5 抗體雜交

（1）將PVDF膜置于封閉液中，室溫封閉45 min，PBST洗膜。

（2）孵育鼠源抗GST抗體（1∶5 000 PBST稀釋），室溫孵育1 h，PBST洗膜。

（3）孵育HRP偶聯羊抗鼠IgG（1∶10 000 PBST稀釋），室溫孵育45 min，PBST洗膜。

3.6 成像檢測

（1）將ECL化學發光試劑盒中的A液和B液1∶1配制，PVDF膜上孵育1 min后棄去。

（2）將PVDF膜放入凝膠成像系統，CCD成像。

4 實驗結果

圖1、2所示是用鼠源抗GST抗體對4份菌體樣品中的GST（大小約26 kD）和GST-GAPDH（大小約63 kD）蛋白進行Western Blotting檢測，二抗為HRP標記的羊抗鼠IgG抗體。其中圖1是經CCD成像的直觀結果，圖2是利用軟件將發光條帶與Marker合成后的結果。

從圖2結果可見，A和B泳道上出現GST相應大小的清晰條帶，C和D泳道上出現GST-GAPDH相應大小的清晰條帶，且誘導組（B和D）分別較對照組（A和C）中目的蛋白表達量有明顯增加，符合實驗預期。但結果中尚存在2個問題：①出現非特異性條帶；②沒有檢測內參（這兩部分內容會在后面的5.4和6.3.4中具體討論）。

圖1 CCD成像結果

圖2 軟件合成結果

5 注意事項

5.1 預染Marker的使用

在Western blotting的SDS-PAGE中，所用的Marker為條帶可見的預染Marker，其作用是不需要經過染色就可以實時觀察電泳進度和Marker條帶的分離情況。在后續的實驗步驟中，它是作為估測轉印效率以及確定最終蛋白條帶大小的重要依據。

5.2 “三明治”結構的組裝

所謂“三明治”結構，是指在濕轉和半干轉操作過程中形成的“（負極）濾紙—凝膠—膜—濾紙（正極）”結構。正確組裝“三明治”結構是將凝膠中的蛋白成功轉印于支撐膜上的關鍵步驟，也是檢驗學生對電泳轉印原理掌握情況的重要標準。組裝三明治結構時方向切勿裝反，并且需要趕走氣泡，保證三明治結構中各層完全貼合，防止氣泡干擾轉印。

5.3 轉印條件的確定

轉印的電壓和時間與目的蛋白的大小、所使用的轉印方法等因素密切相關。當轉印分子量較大的蛋白時，通常采用濕轉，同時可以適當提高電壓或延長轉印時間；對于小分子量蛋白，濕轉和半干轉均可，但切忌電壓過高或轉印時間過長，否則小蛋白容易穿透支撐膜而不能有效轉印。在轉印條件相同的情況下，電壓和時間呈負相關，如需要延長轉印時間，則可以適當降低電壓［7-8］。具體轉印條件需要根據不同實驗內容而定。

5.4 雜交中非特異性結合的降低

本實驗結果中可見非特異性條帶，為盡可能地降低或避免非特異性結合，通常有以下幾個方面需要注意：11抗體孵育時間不宜過長，尤其是二抗，抗體孵育時間越長，則需要增加洗膜次數；22抗體孵育后的漂洗需要在搖床上快速搖動并多次換液，通常以少量多次的洗膜方式效果更好［9］；33延長封閉時間，還可以在封閉液中加入吐溫20。當然，抗體本身的質量好壞以及稀釋倍數的高低對于雜交特異性的影響更是至關重要，需要在實踐中不斷摸索和嘗試。

6 教學實踐

6.1 基礎實驗

分子生物學實驗是面向本院生物科學、生物技術和伯苓班專業大三學生開設的基礎性實驗必修課程，教學內容圍繞“小鼠GAPDH基因的克隆與原核表達”而展開，10項實驗項目分別為：從小鼠肝臟中提取RNA，RT-PCR獲得目的基因，目的基因的純化與回收，載體pGEX-4T-2的制備，目的基因／載體的酶切，酶切片段的回收，目的基因與載體的連接，轉化，轉化子的篩選（菌落PCR），目的蛋白的誘導表達和PAGE分析。

由此可見，基礎實驗教學在教學內容上環環相扣，即上一實驗的產物是下一實驗的材料。整個實驗是從提取小鼠肝臟RNA開始，逐步構建重組DNA分子pGEX-4T-2／GAPDH，并最終通過IPTG誘導獲得原核表達。

在目的蛋白的誘導表達和PAGE分析實驗中，分別對轉化有pGEX-4T-2空載體和pGEX-4T-2／GAPDH重組質粒的菌體進行IPTG誘導，全菌樣品利用SDSPAGE結合考馬斯亮藍染色分析，結果如圖3所示。

圖3 考馬斯亮藍染色結果

從圖3可見，在B泳道中31kD稍下的位置，出現了相對A泳道中同樣位置表達增加的蛋白條帶，理論上應為GST蛋白；在D泳道中66.2kD稍下的位置，出現了相對C泳道中同樣位置表達增加的蛋白條帶，理論上應為GST-GAPDH蛋白。但該方法只是根據蛋白分子量大小進行判斷，并不具有特異性，即使表達量增加的蛋白大小符合預期，也無法完全確定該蛋白就是目的蛋白，這就引發了學生對結果的質疑。

為此，分子生物學實驗課程組結合本科實驗教學特點，在原有教學內容的基礎上設置了“免疫印跡法檢測目的基因在原核細胞中的表達”這一綜合性實驗。該實驗能夠與原有教學內容相互驗證、融會貫通，是對基礎性實驗教學的必要補充與延伸［11］。

6.2 教學模式

由于本實驗內容具有較強的連貫性和綜合性，對學生的理解能力、操作能力和分析能力都有著較高的要求。而基礎實驗課程受眾面廣，學生水平參差不齊，且一定程度上受到課時的限制。為不增加學生的學習負擔，實驗首先面向對該內容感興趣并且學有余力的學生開設，即在完成基礎分子生物學實驗教學后，本著學生自愿參加的原則，根據報名人數進行分組，每組2或3人。教師首先進行必要的理論講解、思路引導以及相關儀器操作示范，每組學生可自行制定實驗方案，如誘導條件（IP TG濃度、誘導時間、誘導溫度）、抗體種類（抗GST抗體、抗GAPDH抗體）以及電泳轉印方法（濕轉、半干轉）等。在隨后的教學過程中，教師只進行必要的答疑解惑，學生可根據自己的時間安排實驗進度。實驗結束后，要求每組學生對自己的實驗結果進行匯報展示，由師生一起對實驗過程中出現的問題及實驗結果進行討論與點評，讓每個學生都能從他人的工作中總結經驗，吸取教訓，取長補短。這樣的研討式分組教學模式，既能夠避免教學中因扎推操作而造成的擁擠現象，大大增加了學生親自動手實踐的機會，更充分突出了學生的主體地位，調動了學生的學習積極性，對于培養學生發現問題、分析問題和解決問題的綜合實踐能力起到積極作用［12］。

6.3 教學探討

6.3.1 兩種轉印方法的比較

蛋白質電泳轉印通常有濕轉和半干轉兩種。二者的原理和過程基本相同。所不同的是，濕轉是將三明治結構全部浸于電轉移緩沖液中，而在半干轉中只有濾紙起到儲存電轉移緩沖液的作用。因此，前者緩沖液用量大，導電能力強，適于長時間轉印，但需要配備冷卻系統，以分散較長時間轉印所產生的熱量；而后者其緩沖液用量少，無需冷卻裝置，使用方便，但緩沖能力有限，所以轉印時間不宜過長，更適于快速轉印。由于分子量較大的蛋白在短時間內快速轉印的轉移效率較低，因此，濕轉的轉移蛋白分子量范圍要更廣一些［7-8］。本實驗的目的蛋白大小適中，對于兩種轉印方法均適用，因此每組學生可以自由選擇嘗試，以提高學生的主觀能動性和綜合實踐能力［13］。

6.3.2 一膜多用

本實驗中pGEX-4T-2空載體表達GST標簽蛋白（大小約26 kD），pGEX-4T-2／GAPDH重組質粒表達GST-GAPDH融合蛋白（大小約63 kD），因此實驗中選用抗GST抗體進行目的蛋白的檢測。值得一提的是，由于編碼GAPDH蛋白的基因來自小鼠，因此，在本實驗結束后，還可以利用膜再生液將膜上的封閉蛋白及抗體除去，經再次封閉后選擇鼠源抗GAPDH抗體重新孵育。又或者，在PVDF膜第一次封閉后，根據膜上Marker大小將膜剪開，分子量較小的部分孵育抗GST抗體，分子量較大的部分既可以孵育抗GST抗體，也可孵育抗GAPDH抗體。學生可以根據不同抗體的雜交結果進行討論和分析，在掌握一膜多用的操作方法基礎上，進一步深化對免疫印跡技術的理解和認知。

6.3.3 檢測和成像方法的選擇

Western Blotting對目的蛋白的檢測方法主要取決于二抗的標記類型，不同的標記則需要采取不同的方式方法進行檢測。本實驗用到的是目前最為常用的辣根過氧化物酶（HRP）標記的酶聯二抗，檢測方法則選用反應速度快、靈敏度高的增強化學發光法（ECL），其原理是辣根過氧化物酶可以催化相應底物發生化學反應，產生發光產物，進而可以利用膠片曝光或CCD系統成像。膠片曝光與CCD系統成像相比，前者需要利用膠片在暗室中進行時間梯度的顯影和定影，成本高，耗時長，過程繁瑣，對于本科生而言操作難度較大，且相關試劑因具有一定的毒性還會給實驗教學帶來安全隱患；而CCD成像速度快，操作簡單安全，無需耗材成本，不僅具有高靈敏度和高分辨率，還能夠利用軟件對結果進行準確計量，因此更適于實驗教學。

6.3.4 上樣量的校正

蛋白免疫印跡法主要用于比較不同條件下目的蛋白的相對變化，而比較的基礎就是等量的樣品上樣量。目前，最為常用的校正上樣量的方法則是在檢測目的蛋白的同時檢測內參。即內部參照，通常是指管家基因表達的蛋白，它們在各組織和細胞中的表達水平相對恒定，基本不受環境因素的影響。內參的檢測不但能夠起到校正上樣量的作用，還可以檢驗實驗體系是否正確穩定，用以排除由于人為等因素給實驗造成的影響。內參蛋白的選擇通常要考慮到樣本種屬、與目的蛋白之間的大小差異以及是否有可用抗體等多種因素。本實驗所用材料為大腸桿菌，理論上可選擇其內源性的GAPDH作為內參，但目前市售的抗體鮮有大腸桿菌來源，雖有文獻報道用鼠源抗GAPDH抗體可以代替，但檢測效果不甚理想，需要對抗體的稀釋度和曝光時間等條件進一步摸索和優化［1-2］。

7 結 語

將科研領域中常用技術手段打造成適于本科教學實踐的實驗內容一直是高校教學改革的重要方向之一［14-15］。為此，我校生物實驗教學中心分子生物學課程組開設了“免疫印跡法檢測目的基因在原核細胞中的表達”這一綜合性項目作為對基礎性實驗教學的擴展。通過優化的實驗內容和合理的教學設計將蛋白質免疫印跡技術引入本科實驗教學，并結合學生基礎和教學實際，采取研討式分組教學模式，讓學生在學習實驗技能的同時，有更多獨立操作與思考的空間，和更多相互交流與借鑒的機會，充分發揮其主觀能動性，使學生的思維方式和實驗素養都能得到嚴謹性、科學性和系統性的訓練，這也是高校創新型人才培養的必然要求［16］。