銅綠假單胞菌對消毒劑的敏感性試驗

許佳敏 邊海霞 周云鋒/寧夏曉鳴農牧股份有限公司 750001

關鍵字：銅綠假單胞菌； 消毒劑；篩選

銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa， Pa)，俗稱綠膿桿菌，廣泛存在于環境中，為一類條件性致病菌。綠膿桿菌常可從雞群及養殖場中分離到，尤其當雞群處于應激狀態時，極易感染，且致死率在 1%～90%，所以合理選用消毒劑對其消滅和防控極為重要。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 樣品孵化絨毛。

1.1.2 試劑安立消，由瑞普（天津）生物藥業有限公司生產；安滅殺，由默沙東動物保健品有限公司生產；衛可，由英國安德國際有限公司生產；百勝，由英國 Evans 生產廠生產； 醛立潔、二氯異氰尿酸鈉、三氯異氰尿酸鈉由寧夏智弘生物有限公司生產。

1.1.3 培養基普通肉湯培養基、普通瓊脂平皿由北京路橋生物有限公司生產；十六烷三甲基溴化銨瓊脂由青島高科園海博生物技術有限公司生產。

1.1.4 儀器生化培養箱由上海躍進醫療器械有限公司生產；立式雙層智能精密性搖床由上海博訊實業有限公司醫療設備廠生產；潔凈工作臺由蘇州尚田潔凈有限公司生產。

1.2方法

1.2.1 細菌分離及鑒定無菌取絨毛0.1g加入10mL生理鹽水，充分混合，作為10-2樣品，以 10 倍稀釋進行10-3、10-4樣品稀釋，稀釋后充分混勻，分別取10-2、10-3、10-4樣品1mL，采用傾注法接種十六烷基三甲基溴化銨瓊脂（銅綠假單胞菌鑒別培養基），置于37℃培養16～30h。挑取典型菌落，與LB肉湯培養基中37℃震蕩培養至對數生長期。按照以上操作純化3次，取菌液1mL，提取DNA，16S 通用引物，進行PCR，將所得產物進行送檢測序。

1.2.2 配置菌株懸液選取已純化3次的單菌落接種到LB肉湯中，37℃震蕩培養至對數生長期，制備濃度為1.0×108CFU/mL的菌懸液。

1.2.3 菌液定量殺菌試驗

1.2.3.1 消毒劑的稀釋 根據各消毒劑推薦的濃度將其稀釋2 倍、10 倍、100 倍。

1.2.3.2 試驗步驟 取稀釋好的各消毒劑 5mL，分別加0.1mL的銅綠假單胞菌，混勻，室溫孵育10min，30min，分別取 0.2mL涂布于普通營養瓊脂培養基上。放于37℃溫箱中培養24h，觀察計數。試驗每組重復3次。同時，設立陰陽對照組，陰性對照不加培養菌液，陽性對照不加消毒劑。

表1 不同濃度消毒劑作用不同時間后細菌殺滅率

1.2.4 同一消毒劑不同濃度，消毒后不同時間內孵化銅綠假單胞菌的檢測根據之前實驗室測定數據確定消毒藥濃度，噴灑或擦拭物體表面，在消毒前、消毒后采集棉拭子，測定銅綠假單胞菌含量，進一步評定消毒藥濃度范圍及消毒間隔。

2 結果

2.1 細菌分離鑒定結果細菌經染色、培養特性，結合產色素特點初步鑒定為綠膿桿菌。16S 基因測序經過Blast分析對比后，與銅綠假單胞菌各菌株16sRNA序列同源性為99%以上。進一步驗證分離的菌株為銅綠假單胞菌。

2.2 菌液定量殺菌試驗結果（見表1）

從表1可以結果看出，銅綠假單胞菌對消毒劑敏感性順序為：立消＝三氯異氰尿酸鈉＞安滅殺＞百勝＞衛可＞醛立潔＞二氯異氰尿酸鈉。

2.3 同一消毒劑不同濃度，消毒后不同時間內孵化銅綠假單胞菌的檢測 使用已篩選消毒劑最高稀釋度及次之稀釋度噴灑、擦拭孵化場發現，安立消、三氯異氰尿酸鈉、安滅殺、百勝對其殺滅效果更有效。這與實驗室篩選濃度相符。

3 討 論

有研究表明表面活性劑類具有殺菌和去污作用，對綠膿桿菌、真菌有效[1]。在本試驗中表面活性劑類消毒劑對本場區綠膿桿菌殺滅效果最好。同樣張媛等表明表面活性劑類消毒劑新潔爾滅對綠膿桿菌殺滅效果良好[2]。氯類、醛類消毒藥三氯異氰尿酸鈉、安滅殺對其殺滅效果也較好，但是因二氯異氰尿酸鈉長期使用已耐藥，效果不理想。這與鄧晶榮等實驗相符。鄧晶榮等表明聚維酮碘、戊二醛、三氯異氰尿酸能夠有效滅殺多耐藥銅綠假單胞菌， 低濃度的聚維酮碘與三氯異氰尿酸能夠在5min內有效滅殺該細菌，而低濃度的戊二醛比聚維酮碘、三氯異氰尿酸的5min滅殺細菌的效果要差[3]。百勝主要成分為碘、磷酸、硫酸對綠膿桿菌殺滅效果也較好。而醛立潔、衛可、二氯異氰尿酸鈉消毒效果不理想。所以合理選擇和正確使用化學消毒劑，確保消毒效果至關重要。