miR-20a-5p靶向調(diào)控BRMS1L對(duì)人結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW480增殖、凋亡能力的影響及其機(jī)制探討

陳杰

湖南省腫瘤醫(yī)院，長沙 410000

結(jié)直腸癌是臨床常見的消化道惡性腫瘤，常發(fā)生在直腸和乙狀結(jié)腸交界處，發(fā)病率在人體惡性腫瘤中居第三位[1]。結(jié)直腸癌起病隱匿，易轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差，病死率較高。因此，探討發(fā)病機(jī)制結(jié)直腸癌對(duì)早期診斷、個(gè)體化治療、提高治療效果、改善患者生存和預(yù)后具有重要意義。微小RNA(miRNA)作為一種內(nèi)源性RNA，其通過靶向mRNA在轉(zhuǎn)錄后水平進(jìn)行翻譯抑制或降解調(diào)節(jié)基因表達(dá)，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化、增殖和凋亡[2]。多項(xiàng)研究[3～5]表明，miRNA可作為抑癌基因或癌基因發(fā)揮作用，參與包括結(jié)直腸癌在內(nèi)的多種腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展和耐藥等生物學(xué)過程。微小RNA-20a-5p(miR-20a-5p)是一種常見的miRNA，其在結(jié)直腸癌中表達(dá)上調(diào)，并發(fā)揮致癌基因的功能[6,7]。然而，miR-20a-5p在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的生物學(xué)作用和確切機(jī)制仍不清楚。生物信息學(xué)分析顯示，乳腺癌轉(zhuǎn)移抑制基因1(BRMS1L)是miR-20a-5p的潛在功能性靶基因之一，BRMS1L是一種新的抑癌基因，在卵巢癌和乳腺癌中表達(dá)下調(diào)，上調(diào)其表達(dá)可抑制癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[8,9]。然而，miR-20a-5p靶向BRMS1L是否參與結(jié)腸癌進(jìn)展尚未可知。本研究觀察了miR-20a-5p靶向調(diào)控BRMS1L對(duì)人結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW480增殖、凋亡能力的影響，并探討其可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株、轉(zhuǎn)染物及主要試劑 人結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW480、DLD-1、HCT116及正常結(jié)直腸黏膜細(xì)胞株FHC購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。miR-20a-5p抑制物(anti-miR-20a-5p)、miR-20a-5p抑制物陰性對(duì)照(anti-miR-NC)、BRMS1L過表達(dá)載體(pcDNA-BRMS1L)、BRMS1L過表達(dá)載體陰性對(duì)照(pcDNA-NC)、miR-20a-5p模擬物(miR-20a-5p mimics)、miR-20a-5p模擬物陰性對(duì)照(miR-NC)及BRMS1L小干擾RNA陰性對(duì)照(si-NC)、BRMS1L小干擾RNA(si-BRMS1L)購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；含有miR-20a-5p結(jié)合位點(diǎn)的BRMS1L-3′UTR野生型(WT-BRMS1L)及突變型(MUT-BRMS1L)報(bào)告基因載體的構(gòu)建由南京諾唯贊生物科技公司提供。DMEM-12、DMEM、RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Hyclone公司；LipofectamineTM2000購自美國Thermo公司；TRIzol試劑、細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK-8)、膜聯(lián)蛋白V異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購自北京索萊寶生物科技公司；兔抗BRMS1L、細(xì)胞周期素D1(CyclinD1)、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved-Caspase-3)、β-連環(huán)蛋白(β-catenin)抗體購自美國Abcam公司；山羊抗兔Ⅱ抗購于上海碧云天公司。

1.2 結(jié)腸癌細(xì)胞株的選擇 采用qRT-PCR法和Western blotting法檢測(cè)FHC、SW480、DLD-1、HCT116細(xì)胞中miR-20a-5p mRNA和BRMS1L mRNA、蛋白。FHC、SW480、DLD-1、HCT116細(xì)胞中miR-20a-5p mRNA分別為1.00±0.10、3.22±0.32、3.01±0.30、2.35±0.24，BRMS1L mRNA分別為1.02±0.11、0.35±0.04、0.44±0.05、0.30±0.03，BRMS1L蛋白分別為1.04±0.12、0.33±0.03、0.42±0.04、0.45±0.05，SW480、DLD-1、HCT116細(xì)胞與FHC細(xì)胞比較，P均<0.05。SW480與FHC細(xì)胞比較差異最為顯著，根據(jù)以上結(jié)果，選擇SW480細(xì)胞作為本研究的實(shí)驗(yàn)細(xì)胞。

1.3 SW480細(xì)胞anti-miR-20a-5p、pcDNA-BRMS1L轉(zhuǎn)染 取SW480細(xì)胞，將細(xì)胞接種到6孔板，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到60%時(shí)利用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染，A、B、C、D、E、F組分別轉(zhuǎn)染anti-miR-20a-5p、anti-miR-NC、pcDNA-BRMS1L、pcDNA-NC、anti-miR-20a-5p+si-BRMS1L、anti-miR-20a-5p+si-NC，6 h后換液，轉(zhuǎn)染48 h，轉(zhuǎn)染合格后，取上述各組細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 轉(zhuǎn)染anti-miR-20a-5p、pcDNA-BRMS1L的SW480細(xì)胞增殖能力觀察 ①存活率：采用CCK-8法。將A、B、C、D、E、F組SW480細(xì)胞按照每孔3 000接種96孔板，培養(yǎng)48 h后，每孔加入10 μL的CCK-8試劑，培養(yǎng)箱孵育2 h。檢測(cè)450 nm的吸光度值(A值)，以空白孔調(diào)零，結(jié)果以細(xì)胞存活率表示，細(xì)胞存活率=(對(duì)照組A值/實(shí)驗(yàn)組A值)×100%。②CyclinD1蛋白：采用Western blotting法。將A、B、C、D、E、F組SW480細(xì)胞接種到6孔板，細(xì)胞密度為80%時(shí)，采用Western blotting法檢測(cè)細(xì)胞中CyclinD1蛋白。CyclinD1蛋白相對(duì)表達(dá)量=CyclinD1灰度值/β-actin灰度值。

1.5 轉(zhuǎn)染anti-miR-20a-5p、pcDNA-BRMS1L的SW480細(xì)胞凋亡能力觀察 ①凋亡率：采用Annexin V-FITC/PI雙染法。將A、B、C、D、E、F組SW480細(xì)胞接種到6孔板，細(xì)胞密度為80%時(shí)，用胰蛋白酶消化各組細(xì)胞，離心收集細(xì)胞沉淀，添加500 μL的結(jié)合緩沖液，加入Annexin V-FITC和PI染液各5 μL，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡變化，結(jié)果以細(xì)胞凋亡率表示。②Cleaved-Caspase-3蛋白：檢測(cè)方法參照“1.4”中CyclinD1蛋白的檢測(cè)方法。

1.6 轉(zhuǎn)染anti-miR-20a-5p、pcDNA-BRMS1L的SW480細(xì)胞β-catenin蛋白檢測(cè) 檢測(cè)方法參照“1.4”中CyclinD1蛋白的檢測(cè)方法。

1.7 miR-20a-5p與BRMS1L之間靶向關(guān)系、調(diào)控作用驗(yàn)證 ①靶向關(guān)系：采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。將miR-20a-5p mimics、miR-NC分別與WT-BRMS1L或MUT-BRMS1L共轉(zhuǎn)染至SW480細(xì)胞(分別記為G、H組)，轉(zhuǎn)染48 h，采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)兩組細(xì)胞熒光素酶活性。②調(diào)控作用：采用Western blotting法。將SW480細(xì)胞接種到6孔板，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到60%時(shí)，將miR-20a-5p mimics、miR-NC、anti-miR-20a-5p、anti-miR-NC分別轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞(分別記為I、J、K、L組)，48 h后采用Western blotting法檢測(cè)BRMS1L蛋白。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞存活率、凋亡率及CyclinD1、Cleaved-Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 細(xì)胞存活率、凋亡率及CyclinD1、Cleaved-Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量比較見表1。

表1 各組細(xì)胞存活率、凋亡率及CyclinD1、Cleaved-Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

注：與B組比較，*P<0.05；與D組比較，△P<0.05；與F組比較，﹟P<0.05。

2.2 各組β-catenin蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 A、B、C、D、E、F組β-catenin蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.36±0.04、0.72±0.07、0.42±0.03、0.70±0.06、0.60±0.06、0.34±0.03，anti-miR-20a-5p組、anti-miR-NC組比較，pcDNA-BRMS1L組、pcDNA-NC組比較，anti-miR-20a-5p+si-BRMS1L組、anti-miR-20a-5p+si-NC組比較，P均<0.05。

2.3 各組細(xì)胞熒光素酶活性及BRMS1L蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 兩組細(xì)胞熒光素酶活性比較見表2。I、J、K、L組BRMS1L蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.12±0.01、0.36±0.04、0.82±0.08、0.38±0.05，I、J組比較，K、L組比較，P均<0.05。

表2 兩組細(xì)胞WT-BRMS1L、MUT-BRMS1L相對(duì)熒光素酶活性比較

注：與H組比較，*P<0.05。

3 討論

結(jié)直腸癌又叫大腸癌，是指大腸上皮來源的癌癥，好發(fā)于40歲以上的中老年人，且男性多于女性，多數(shù)患者后期可出現(xiàn)大便性狀改變、便血和腹痛。雖然外科手術(shù)治療、術(shù)后放化療、靶向治療等綜合治療手段不斷改善，但每年全球新增結(jié)腸癌患者高達(dá)100萬例，且死亡人數(shù)超過69萬例[1]，是亟待解決的全球公共衛(wèi)生問題。結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW480、DLD-1、HCT116是研究結(jié)直腸癌常用的體外細(xì)胞模型，本研究通過探討人正常結(jié)直腸黏膜細(xì)胞株FHC和結(jié)直腸癌細(xì)胞株DLD-1、HCT116、SW480中miR-20a-5p和BRMS1L表達(dá)變化，選取miR-20a-5p表達(dá)最高、BRMS1L表達(dá)較低的SW480細(xì)胞進(jìn)行功能試驗(yàn)，并探討miR-20a-5p和BRMS1在結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和凋亡中的作用，以期為結(jié)直腸癌防治提供新的策略。

miRNA作為人類疾病的重要參與者，其在包括結(jié)腸癌在內(nèi)的多種腫瘤中表達(dá)失調(diào)并參與細(xì)胞增殖失控、凋亡抑制和促進(jìn)侵襲轉(zhuǎn)移過程地調(diào)控。miR-20a-5p是一種致癌基因，既往研究顯示肝癌[10]、三陰性乳腺癌[11]中miR-20a-5p呈高表達(dá)，其高表達(dá)促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的生長、遷移和侵襲。然而，在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中,miR-20a-5p卻表達(dá)下調(diào)，并發(fā)揮抑癌基因作用[12]。BRMS1與組蛋白去乙?；浮⑻囟ǖ霓D(zhuǎn)錄因子形成復(fù)合物，從而調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達(dá)，抑制多種腫瘤類型的轉(zhuǎn)移。研究[13]顯示，BRMS1在結(jié)腸癌中表達(dá)降低，檢測(cè)BRMS1是判斷結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移和預(yù)后情況的重要指標(biāo)。BRMS1L是BRMS1的類似物，腺癌組織中BRMS1L的表達(dá)降低與轉(zhuǎn)移以及患者較差的生存相關(guān)，BRMS1L通過誘導(dǎo)FZD10表觀遺傳沉默抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移[14]。在膠質(zhì)瘤中，BRMS1L表達(dá)降低與高級(jí)別膠質(zhì)瘤以及生存分析中較高的病死率顯著相關(guān)[15]。miR-934通過靶向BRMS1L促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡[16]。miR-93-5p通過靶向BRMS1L調(diào)控Wnt信號(hào)通路促進(jìn)淚腺腺樣囊性癌的發(fā)生[17]。本研究通過功能缺失、獲得實(shí)驗(yàn)分析miR-20a-5p和BRMS1L在結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、凋亡中的作用，發(fā)現(xiàn)抑制miR-20a-5p表達(dá)、過表達(dá)BRMS1L均可降低SW480細(xì)胞存活率，并升高細(xì)胞凋亡率。同時(shí)雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)，BRMS1L是miR-20a-5p的靶基因，miR-20a-5p可在蛋白水平負(fù)性調(diào)控BRMS1L表達(dá)。此外恢復(fù)實(shí)驗(yàn)顯示，抑制BRMS1L表達(dá)還可部分逆轉(zhuǎn)抑制miR-20a-5p對(duì)SW480增殖和凋亡的影響。以上研究說明，miR-20a-5p通過靶向BRMS1L在結(jié)直腸癌進(jìn)展中發(fā)揮作用。

CyclinD1又叫G1/S-特異性周期蛋白-D1，其通過激活G1期特有的周期蛋白依賴性激酶，促進(jìn)G1周期抑制蛋白的磷酸化，推動(dòng)細(xì)胞周期向S期過渡，其過度表達(dá)可致細(xì)胞增殖失控而惡性化，是目前公認(rèn)為原癌基因[18～20]。研究顯示，上調(diào)miR-20a-5p表達(dá)可有效降低腎小管上皮細(xì)胞中CyclinD1表達(dá)，誘導(dǎo)G1期阻滯，抑制細(xì)胞增殖[21]。Caspase-3是細(xì)胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，Caspase-3的活化可引起細(xì)胞不可逆凋亡[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，抑制miR-20a-5p表達(dá)、過表達(dá)BRMS1L均可降低SW480細(xì)胞中CyclinD1蛋白表達(dá)，升高Cleaved-Caspase-3蛋白的表達(dá)，且抑制BRMS1L表達(dá)還可部分逆轉(zhuǎn)抑制miR-20a-5p對(duì)SW480細(xì)胞CyclinD1蛋白和Cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)的影響。說明抑制miR-20a-5p通過靶向上調(diào)BRMS1L可有效抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

Wnt/β-catenin信號(hào)通路是一條經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路，在多數(shù)情況下，β-catenin的過度活化可誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生。研究[23～25]顯示，在多種結(jié)直腸癌中腫瘤抑制基因的突變可阻礙β-catenin的降解和磷酸化，引起β-catenin在細(xì)胞核聚集，結(jié)合T細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子和淋巴細(xì)胞增強(qiáng)因子，促進(jìn)下游原癌基因表達(dá)，而抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路活化對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和耐藥有明顯的抑制作用，提示W(wǎng)nt/β-catenin信號(hào)通路是結(jié)直腸癌的潛在治療靶點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)，抑制miR-20a-5p表達(dá)、過表達(dá)BRMS1L均可抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路活化，而抑制BRMS1L表達(dá)還可部分逆轉(zhuǎn)抑制miR-20a-5p對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的影響。提示miR-20a-5p通過靶向BRMS1L表達(dá)參與結(jié)直腸癌進(jìn)展和調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路有關(guān)。

總之，抑制miR-20a-5p通過靶向BRMS1L可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，機(jī)制可能與其抑制Wnt/β-catenin信通路有關(guān)。