胃腸道間質瘤組織中FAM96A、FAM96B、Caspase3表達觀察

楊道麗，成元華，張亞娟，成元冬，龔靈

1貴州醫科大學，貴陽 550004；2貴州醫科大學附屬醫院；3貴州省腫瘤醫院

胃腸道間質瘤(GIST)是胃腸道最常見的間葉源性腫瘤，大多數病例存在CKIT基因或PDGFRA基因活化突變[1]。目前，針對GIST最有效的治療手段是根治性手術切除和分子靶向藥物治療，但完整手術切除的患者仍可能發生轉移[2]。對不能切除或復發、轉移的GIST患者，使用分子靶向藥物是首選的治療方法[3]，但易出現耐藥，使高復發風險的患者難以獲得長期生存。96序列相似的家庭成員A(FAM96A)是廣泛表達且高度保守的小分子凋亡激活蛋白，FAM96B是小分子蛋白，兩者屬同源蛋白，約50%的序列相同，其肽鏈中間均為DUF59結構域，含有該結構域的蛋白可能與鐵硫簇蛋的白組裝及DNA修復等功能相關[4～6]。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)家族是凋亡的重要調節因素，Caspase3作為Caspase家族中最關鍵的成員，是凋亡的執行者，也是凋亡細胞Caspase級聯反應必經的共同通路[7,8]。細胞凋亡可以通過內源性途徑和外源性途徑誘導[9]，其中內源性細胞凋亡途徑是線粒體介導的半胱天冬酶激活途徑，又稱線粒體通路。Schwamb等[10]首次提出FAM96A抑制腫瘤發生發展的具體機制可能與線粒體凋亡途徑有關，并且發揮該功能的區域為FAM96A中的DUF59結構域，FAM96A基因缺失在GIST形成過程中起重要作用。FAM96B和FAM96A為同源蛋白，二者均含DUF59結構域，推測FAM96B也與GIST的發生發展有關，也可能通過線粒體凋亡途徑有效誘導GIST腫瘤細胞的凋亡，而Caspase3作為凋亡細胞Caspase級聯反應必經的共同通路。本研究觀察了GIST組織中FAM96A、FAM96B、Caspase3蛋白及FAM96A、FAM96B mRNA表達變化，旨在為進一步了解GIST的發生發展機制及探索新的治療方法提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2014年9月～2018年9月貴州醫科大學附屬醫院收治的GIST患者120例，男48例，女72例；年齡29～82歲，中位年齡59歲；年齡≤59歲71例，>59歲49例；腫瘤發生部位位于胃81例，腸31例，胃腸外8例；腫瘤直徑≤5 cm 56例，>5 cm 64例；核分裂像≤5/50 HPF 93例，>5/50HPF 27例；依據GIST核分裂像多少及腫瘤直徑進行危險度分級[11]，其中極低和低危險度分級49例，中危險度分級32例，高危險度分級39例。手術留取GIST組織140例份(120例份用于免疫組化檢測、20例份用于RT-PCR檢測，分別記為腫瘤1組、腫瘤2組)和正常組織130例份(120例份用于免疫組化檢測、10例份用于RT-PCR檢測，分別計正常1組、正常2組)。

1.2 GIST組織中FAM96A、FAM96B、Caspase3蛋白檢測 采用免疫組化EnVision二步法。FAM96A、FAM96B、Caspase3抗體稀釋度分別為1∶800、1∶600及1∶500。FAM96A與FAM96B用檸檬酸鹽溶液(pH6.0)高溫高壓抗原修復，Caspase3用 EDTA(pH9.0)高溫高壓抗原修復；修復時間均為3 min。嚴格按照常規免疫組化方法染色，二氨基聯苯胺(DAB)顯色，蘇木素復染細胞核，PBS代替一抗作為空白對照。FAM96A、FAM96B、Caspase3蛋白的陽性表達均定位于細胞質，呈棕黃色或棕褐色顆粒。使用軟件Imageproplus分析光密度法(積分光密度值IOD/區域面積ARE)對免疫組化染色結果進行定量分析；采用鏡下陽性細胞數占腫瘤細胞總數的百分率和腫瘤細胞著色強度綜合進行定性分析。依照陽性細胞所占比例，占<5%、5%～25%、26%～50%、51%～75%、>75%分別記為0、1、2、3、4分；依照著色強度，未著色計0分，淺黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分；將二者得分相乘后取5個視野得分的平均值記為最終分數，根據最終分數分成4種等級，0～1分為-，2～4分為+，5～8分為++，9～12分為+++，將++和+++定義為陽性。

1.3 GIST組織中FAM96A、FAM96B mRNA檢測 采用RT-PCR法檢測。FAM96A及FAM96B基因引物用Primer5.0引物軟件自行設計，基因引物及β-actin內參引物均由上海生工生物工程有限公司合成，FAM96A：5′-GGTCTCGGAAAGTTGTGTGGA-3′，5′-CAGCCCAATA-AGAGTCGCCA-3′；FAM96B：5′-ACAGTGGCTGTGGCTT-TCAC-3′，5′-AGCGCAAAGCTTGACCTTG-3′；β-actin：5′-CCTGGCACCCAGCACAAT-3′，5′-GGGCCGGACTCGTCA-TAC -3′。根據石蠟包埋組織RNA提取試劑盒說明書進行操作，提取出組織總mRNA，用核酸定量儀測量總RNA濃度和純度，取吸光度比值(A260/A280)在1.8～2.0的樣本進行后續實驗。按照逆轉錄試劑盒使用說明書合成cDNA，將逆轉錄合成的cDNA置-20 ℃保存備用。RT-PCR總反應體系25 μL：SYBR Green 12.5 μL，上下引物各1 μL(濃度均為10 μmol/L)，cDNA 2 μL，焦碳酸二乙酯水調節至總體積25 μL。反應條件為變性、退火及延伸，設定40個循環。本實驗中FAM96A、FAM96B及β-actin總反應體系和反應條件均相同，由RT-PCR儀自動生成數據，得出Ct值，以2-ΔΔCt代表FAM96A、FAM96B mRNA相對表達量。

2 結果

2.1 兩組FAM96A、FAM96B、Caspase3蛋白陽性率比較 腫瘤1組和正常1組FAM96A蛋白陽性率分別為14.2%(17/120)、91.7%(110/120)，FAM96B蛋白陽性率分別為21.7%(26/120)、89.2%(107/120)，Caspase3蛋白陽性率分別為65.0%(78/120)、90.0%(108/120)，兩組比較，P均<0.05。

2.2 FAM96A、FAM96B、Caspase3蛋白表達與GIST臨床病理參數的關系 結果見表1，由表1可知，FAM96A、FAM96B蛋白陽性表達與腫瘤1組GIST腫瘤直徑、危險度分級有關(P均<0.05)，與患者性別、年齡、發生部位、核分裂像無相關性(P均>0.05)；Caspase3蛋白陽性表達與GIST患者性別、年齡、發生部位、腫瘤直徑、核分裂像、危險度分級均無相關性(P均>0.05)。

表1 FAM96A、FAM96B、Caspase3蛋白表達與GIST臨床病理參數的關系

2.3 GIST組織中FAM96A、FAM96B、Caspase3蛋白表達的相關性 Spearman等級相關分析結果顯示，腫瘤1組GIST組織中FAM96A、FAM96B蛋白表達與Caspase3蛋白表達均無相關性(P均>0.05)。

2.4 兩組FAM96A、FAM96B mRNA相對表達量比較 腫瘤2組、正常2組FAM96A mRNA相對表達量分別為0.55±0.23、1，FAM96B mRNA相對表達量分別為1.22±0.66、1，兩組FAM96A mRNA相對表達量比較，P<0.05。

3 討論

GIST是胃腸道最常見的間葉源性腫瘤，占全部胃腸道惡性腫瘤的2%～3%[12]。盡管伊馬替尼等分子靶向藥物已經成為手術后、不可切除的及轉移性GIST的首選治療藥物，并使患者獲得較長的無進展生存(PFS)和較高的總生存(OS)，但耐藥現象和不良反應仍不能避免[13]。伊馬替尼出現耐藥后，臨床上應用二線藥物舒尼替尼和三線藥物瑞戈非尼治療，但治療效果都沒有達到或接近伊馬替尼，且不良反應也比較明顯，甚至有研究報道采用舒尼替尼和瑞戈非尼快速交替的治療方案，但治療結果未見報道[14]。文獻[15]報道，大多數GIST患者出現耐藥的最常見原因是基因發生再突變或多基因突變。腫瘤形成過程中發生了復雜的分子變化，包括原癌基因激活、腫瘤抑制基因的滅活或丟失、凋亡調節基因和DNA修復基因功能紊亂。癌基因和抑癌基因作用失衡是惡性腫瘤發生發展的關鍵環節。因此，對某些具有潛在調控作用的基因進一步研究是有必要的，可為腫瘤發生發展機制提出新的見解及探索新的診療方法提供理論依據。

FAM96A、FAM96B能與鐵硫(Fe/S)輔助因子結合參與鐵穩態調節，Fe/S蛋白在DNA復制和修復、染色體分離及核糖體蛋白翻譯過程中起重要作用[4]。Yang等[16]認為，FAM96B作為堿性螺旋-環-螺旋蛋白E2-2的調節基因，在血管內皮細胞的增殖、遷移和微管形成中發揮重要作用。Chen等[17]發現，FAM96B和硒蛋白W結合與大腦發育和神經退行性病變有關，能導致細胞周期停滯，進而啟動DNA損傷修復，并維持基因組穩定性。研究[18]顯示，保守的DUF59結構域與維持基因組穩定性有關。以上研究提示，FAM96A和FAM96B在細胞增殖中起著重要作用。國內部分研究已經證實，FAM96A和FAM96B在消化道上皮源性惡性腫瘤(如胃癌及肝癌等)中呈低表達，過表達的FAM96A和FAM96B能抑制腫瘤細胞增殖，并誘導其凋亡，有望成為惡性腫瘤潛在的診斷和治療靶點[19～21]。Schwamb等[10]發現，FAM96A通過線粒體凋亡通路能有效誘導GIST細胞的凋亡，該蛋白在大多數GIST中表達顯著降低。本研究顯示，FAM96A、FAM96B蛋白在GIST腫瘤組織中的表達較正常組織中減少，FAM96A mRNA在GIST腫瘤組織中的表達量較正常組織減少。研究[19～21]發現，FAM96A、FAM96B表達與胃癌、結腸癌、肝癌等的發生發展、侵襲、轉移相關。本文結果顯示，FAM96A、FAM96B蛋白表達與GIST的腫瘤直徑、危險度分級有關，提示FAM96A、FAM96B在GIST的發生發展過程中有一定作用，隨著腫瘤直徑增大和(或)危險度分級增高，其表達減少甚至缺失。本研究只對30例蠟塊組織進行FAM96A、FAM96B mRNA的定量進行研究，考慮樣本量較小，故未在分子層面分析二者與GIST患者的臨床病理參數之間的關系。此外，FAM96B mRNA在GIST腫瘤組織中的表達量與正常組織中無差異，這與既往報道的胃腸道上皮源性惡性腫瘤的表達情況不一致，分析可能與石蠟包埋組織RNA降解明顯、GIST間質中的血管也表達FAM96B蛋白、本實驗樣本量相對較小及腫瘤類型不同等因素有關。

Caspase3作為細胞凋亡途徑的主要執行者，在大多數凋亡事件中高表達，是凋亡過程重要的調節基因，其表達情況用于評估細胞凋亡水平[22～24]。本研究顯示，Caspase3蛋白在GIST腫瘤組織中的表達較正常組織減少，推測Caspase蛋白表達的降低與GIST的發生有一定關系。文獻[10]報道，FAM96A通過線粒體凋亡通路有效誘導GIST細胞的凋亡，而FAM96A、FAM96B的一級結構有50%序列相同，兩者的已知功能相似，提示FAM96B也可能通過線粒體凋亡通路誘導細胞凋亡。本研究對FAM96A、FAM96B蛋白與凋亡關鍵蛋白Caspase3的相關性進行了分析，結果顯示FAM96A、FAM96B蛋白表達與Caspase3蛋白表達均無相關性，考慮到凋亡途徑步驟復雜、受多基因共同調控及Caspase3是多條凋亡途徑的共同下游效應成分，同時考慮本實驗樣本量相對較小等因素，關于FAM96A和FAM96B在GIST腫瘤組織中表達減少的具體機制還需深入研究。本研究旨在研究GIST中FAM96A及FAM96B的表達情況，并進一步探討FAM96A及FAM96B在GIST中發揮生物功能機制是否與線粒體凋亡途徑有關，故未研究Caspase3 mRNA在GIST腫瘤組織中的表達情況。

總之，FAM96A、FAM96B、Caspase3在GIST組織中呈低表達，FAM96A和FAM96B可能作為新的抑癌基因，其表達的減少甚至缺失可能抑制了GIST腫瘤細胞的凋亡，這為臨床提供了新的治療靶點和思路。