黃芪多糖對梗阻性黃疸大鼠腸損害的治療作用及其機(jī)制探討

黃忠義，陳飛，張貫啟，鄔善敏

武漢大學(xué)人民醫(yī)院，武漢 430000

梗阻性黃疸(OJ)在充分的術(shù)前評(píng)估和術(shù)后護(hù)理仍具有較高的病死率，其主要原因?yàn)槟c黏膜屏障破壞、腸源性毒血癥形成，最終導(dǎo)致多器官功能不全[1,2]。基礎(chǔ)和臨床研究[1]已證明，OJ可導(dǎo)致腸內(nèi)細(xì)菌移位和內(nèi)毒素血癥，這是導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)及嚴(yán)重并發(fā)癥的關(guān)鍵因素，其中小腸黏膜屏障功能損害是最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。所以，減輕OJ患者腸損害對預(yù)后至關(guān)重要。全身炎癥反應(yīng)又可加重OJ的病情，炎癥因子包括促炎因子和抗炎因子，TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8作為促炎因子可促進(jìn)炎癥的發(fā)展，相反抗炎因子IL-1Ra、IL-4、IL-6、IL-10、IL-11、IL-13可通過調(diào)節(jié)促炎因子的反應(yīng)來阻止這一過程，這是生物組織對炎性過程的保護(hù)反應(yīng)[3]。APS是從黃芪根中提取的多糖，具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗氧化、抗腫瘤和抗病毒活性等功能[4～9]。雖然有許多研究表明APS具有抗炎作用，但是對OJ腸功能是否有保護(hù)作用仍然不清楚。2019年4～9月，我們觀察了APS對OJ大鼠腸損害的治療作用，并探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物及主要試劑 APS生理鹽水溶液(40 mg/mL，Sigma公司)。TLR4、NF-κB P65、PCNA一抗購自南京建成公司，TNF-α、IL-1β、IL-Ra、IL-10的ELISA試劑盒購自安迪生物，DAO檢測試劑盒和I-FABP檢測試劑盒購自武漢谷歌生物有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 雄性Wistar大鼠48只，10～12周齡，均購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。所有大鼠均在武漢大學(xué)人民醫(yī)院動(dòng)物中心飼養(yǎng)，環(huán)境溫度控制在25 ℃，模擬12 h白天/12 h夜晚的晝夜循環(huán)，自由進(jìn)食水。所有大鼠隨機(jī)分為干預(yù)組、模型組、對照組各16例。

1.3 OJ模型制備、APS應(yīng)用及標(biāo)本取材 手術(shù)操作均在異氟烷吸入麻醉下進(jìn)行。腹部正中行長約2 cm左右的縱切口切開皮膚，再用止血鉗向上輕提腹壁，剪刀剪開腹壁進(jìn)入腹腔。充分止血后將胃向上翻起露出十二指腸及膽總管，再用眼科鑷鈍性分離膽總管至左右膽管匯合處。模型組及干預(yù)組在靠近左右膽管匯合處雙重結(jié)扎并離斷，對照組僅分離膽總管。術(shù)后每天灌胃時(shí)觀察大鼠毛發(fā)及鞏膜黃染情況來評(píng)估造模情況。模型組有1只在術(shù)后9天死亡，解剖發(fā)現(xiàn)為膽漏造成腹腔感染而死，其余老鼠正常，該老鼠直接剔除未進(jìn)行增補(bǔ)。在造模24 h之后，干預(yù)組大鼠灌胃給予APS生理鹽水溶液(100 mg/kg)，對照組及模型組灌胃給予同量生理鹽水，2次/d，分別為08∶00和20∶00兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)。各組大鼠在實(shí)驗(yàn)14天時(shí)取血，血液均取自下腔靜脈,靜止30 min后于4 ℃低溫下離心，以12 000 r/min速度離心10 min，取血清，并凍于-80 ℃深低溫冰箱備用。取血后處死，取肝臟左外葉肝組織和上段小腸組織，部分用4%中性多聚甲醛固定24 h，制備石蠟切片，待光鏡觀察。另一部分放入凍存管，于-80 ℃深低溫冰箱冰凍保存，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)檢測。

1.4 大鼠血清DOA、I-FABP及組織增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)蛋白檢測

1.4.1 血清DOA、I-FABP 采用ELISA法。具體操作步驟：①抗鼠二胺氧化酶單抗包被于酶標(biāo)板上，標(biāo)本和標(biāo)準(zhǔn)品中的二胺氧化酶會(huì)與單抗結(jié)合，游離的成份被洗去。②加入酶標(biāo)抗體，抗鼠二胺氧化酶抗體與結(jié)合在單抗上的鼠二胺氧化酶結(jié)合而形成免疫復(fù)合物，游離的成分被洗去。③加入顯色底物，若反應(yīng)孔中有二胺氧化酶，辣根過氧化物酶會(huì)使無色的顯色劑現(xiàn)藍(lán)色，加終止液變黃。在450 nm處測OD值，二胺氧化酶濃度與OD450值之間呈正比，可通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中的二胺氧化酶濃度。I-FABP的方法原理同DAO的檢測方法。

1.4.2 組織增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)蛋白 采用Western blotting法。具體步驟：①小腸組織總蛋白提取，在冰上配置裂解液，體積比為RIPA∶cocktail∶PMSF=100∶2∶1，超聲裂解小腸組織，裂解液12 000 g，4 ℃離心5 min。②BCA法測定蛋白濃度，比色分析，測定595 nm處的OD值。于Excel表中根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)得出的公式計(jì)算樣本濃度。③SDS-PAGE電泳。④轉(zhuǎn)膜。⑤封閉：膜用TBST沖洗干凈，將膜用移至含有脫脂牛奶的平皿中搖床上室溫封閉1.5 h。⑥孵育一抗，從封閉液中取出膜，用TBST清洗3次，每次5 min。將一抗PCNA(1∶2 000)，GAPDH(1∶8 000)用封閉液稀釋至適當(dāng)濃度。⑦孵育二抗，選擇和一抗種屬相對應(yīng)的二抗，室溫孵育1.5 h。用TBST在室溫下脫色搖床上分別清洗10、5、5 min，3次。免疫反應(yīng)條帶在奧德賽雙色紅外激光掃描系統(tǒng)(LI-COR Biosciences)上顯示。蛋白定量采用Image Pro 6.0軟件對條帶進(jìn)行掃描定量，統(tǒng)計(jì)灰度值的結(jié)果。

1.5 大鼠小腸組織腺窩深度、絨毛高度觀察及上皮細(xì)胞凋亡數(shù)計(jì)數(shù)

1.5.1 組織腺窩深度、絨毛高度 將小腸組織切成厚薄為14 μm的切片，并行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察腺窩深度、絨毛高度，評(píng)估小腸病理損害程度。

1.5.2 組織上皮細(xì)胞凋亡數(shù) 采用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶dUTP鎳端標(biāo)記法(TUNEL)。具體步驟：①石蠟切片脫蠟，依次將切片放入二甲苯Ⅰ、20 min，二甲苯Ⅱ、20 min，無水乙醇Ⅰ、10 min，無水乙醇Ⅱ、10 min，85%酒精、10 min，75%酒精、10 min，蒸餾水。②修復(fù)，切片稍微甩干后用組化筆在組織周圍畫圈，在圈內(nèi)滴加蛋白酶K工作液覆蓋組織，37 ℃溫箱孵育25 min，稍后用PBS(pH7.4)清洗3次，每次5 min。③破膜，將切片稍微甩干后在圈內(nèi)加破膜工作液覆蓋組織，常溫下孵育20 min，稍后用PBS(pH7.4)清洗3次，每次5 min。④加試劑1、2，取Tunel試劑盒內(nèi)適量試劑1(TdT)和試劑2(dUTP)按1∶9混合，加到圈內(nèi)覆蓋組織，置于濕盒內(nèi)37 ℃溫箱孵育2 h。⑤DAPI復(fù)染細(xì)胞核，切片用PBS(pH7.4)洗滌3次，每次5 min。稍甩干后在圈內(nèi)滴加DAPI染液，避光室溫孵育10 min。最后封片觀察。有熒光表達(dá)的為凋亡細(xì)胞。

1.6 大鼠小腸組織IL-1β、TNF-α、IL-1Ra、IL-10檢測 取小腸組織勻漿液，以3 000 r/min的速度離心10 min，取上清液，利用ELISA檢測試劑盒檢測。具體步驟：①ELISA試劑盒實(shí)驗(yàn)前在室溫下平衡20 min后再從鋁箔袋中取出所需板條。②設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL。③樣本孔中加入待測樣本50 μL，空白孔不加。④除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的檢測抗體100 μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37 ℃水浴鍋或恒溫箱溫育60 min。⑤棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液(350 μL)，靜置1 min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次(也可用洗板機(jī)洗板)。⑥每孔加入底物A、B各50 μL，37 ℃避光孵育15 min。⑦每孔加入終止液50 μL，15 min內(nèi)在450 nm波長處測定各孔的OD值。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，每種炎癥因子均檢測3次，最后取平均值作為最終結(jié)果。

1.7 大鼠小腸組織TLR4、NF-κB P65陽性細(xì)胞數(shù)及蛋白檢測

1.7.1 TLR4、NF-κB P65陽性細(xì)胞數(shù) 采用免疫熒光染色法。具體步驟：①石蠟切片脫蠟，依次將切片放入二甲苯Ⅰ、15 min，二甲苯Ⅱ、15 min，無水乙醇Ⅰ、5 min，無水乙醇Ⅱ、5 min，85%酒精、5 min，75%酒精、5 min，蒸餾水。②抗原修復(fù)，將石蠟切片脫水后于EDTA抗原修復(fù)緩沖液(pH8.0)中在微波爐中進(jìn)行抗原修復(fù)，中火8 min，停火8 min，轉(zhuǎn)中低火7 min。修復(fù)過程中防止干片，自然冷切后置于PBS(pH7.4)中洗滌3次，每次5 min。③用組化筆在組織周圍畫圈，用BSA封閉30 min。④加一抗，一抗TLR4(1∶200)，P-P65(1∶100)。輕輕甩掉封閉液，加一抗后置于濕盒內(nèi)4 ℃孵育過夜。⑤加二抗，熒光二抗CY3山羊抗兔(1∶300)。PBS洗滌3次，每次5 min。加二抗后避光室溫孵育50 min。⑥D(zhuǎn)API復(fù)染細(xì)胞核，再用PBS洗滌3次，每次5 min，加DAPI染液，避光室溫孵育10 min。最后封片觀察。

1.7.2 TLR4、NF-κB P65蛋白 采用Western blotting法，具體步驟參照“1.4.2”方法。

2 結(jié)果

2.1 各組血清DAO、I-FABP水平及組織PCNA蛋白表達(dá)量比較 血清DAO、I-FABP水平及組織PCNA蛋白表達(dá)量比較見表1。

表1 各組血清DAO、I-FABP水平及組織PCNA蛋白表達(dá)量比較

注：與對照組比較，▲P<0.05；與模型組比較，★P<0.05。

2.2 各組小腸組織黏膜腺窩深度、絨毛高度比較 小腸組織黏膜腺窩深度、絨毛高度比較見表2。

表2 各組小腸組織黏膜腺窩深度、絨毛高度比較

注：與對照組比較，▲P<0.05；與模型組比較，★P<0.05。

2.3 各組小腸組織上皮細(xì)胞凋亡數(shù)比較 干預(yù)組、模型組、對照組小腸上皮細(xì)胞凋亡數(shù)分別為(10.5±1.1)、(118.4±5.0)、(50.38±3.2)個(gè)/104μm2，模型組與對照組比較，干預(yù)組與模型組比較，P均<0.05。

2.4 各組小腸組織IL-1β、TNF-α、IL-1Ra、IL-10表達(dá)量比較 組織IL-1β、TNF-α、IL-1Ra、IL-10表達(dá)量比較見表3。

表3 各組小腸組織IL-1β、TNF-α、IL-1Ra、IL-10表達(dá)量比較

注：與對照組比較，▲P<0.05；與模型組比較，★P<0.05。

2.5 各組小腸組織TLR4、NF-κB P65陽性細(xì)胞數(shù)及蛋白表達(dá)量比較 組織TLR4、NF-κB P65陽性細(xì)胞數(shù)及蛋白表達(dá)量比較見表4。

表4 各組小腸組織TLR4、NF-κB P65陽性細(xì)胞數(shù)及蛋白表達(dá)量比較

注：與對照組比較，▲P<0.05；與模型組比較，★P<0.05。

3 討論

OJ發(fā)生時(shí)，腸黏膜屏障功能障礙是胃腸道主要的病理改變。這是由于腸道膽汁缺乏、腸道菌群失衡、氧化應(yīng)激、腸黏膜萎縮、腸上皮細(xì)胞間的緊密連接被破壞所致[1,10]。其次，OJ會(huì)導(dǎo)致胃腸道平滑肌張力降低，蠕動(dòng)減弱，消化腺萎縮分泌減少，出現(xiàn)腹脹、便秘、消化吸收不良的癥狀。所以，保護(hù)OJ腸功能對臨床治療很有意義。對OJ腸功能的保護(hù)還處于研究階段，臨床上還沒有特異性的保護(hù)OJ腸功能的藥物。劉俊等[11]發(fā)現(xiàn)，前列腺素E1對OJ腸黏膜屏障有保護(hù)作用，可減少內(nèi)毒素血癥的發(fā)生，對改善預(yù)后有一定得作用。重組人生長激素可影響OJ腸黏膜IL-18表達(dá)從而改善腸黏膜屏障功能[12]。黃芩苷能抑制OJ大鼠腸道炎性反應(yīng)，減輕腸黏膜損傷，保護(hù)腸黏膜屏障的功能[13]。在臨床上，采用蛋白質(zhì)型制劑的腸內(nèi)營養(yǎng)(EN)可保護(hù)患者腸黏膜屏障功能，促進(jìn)胃腸肝臟功能恢復(fù)，改善機(jī)體免疫功能有積極作用，可顯著減少并發(fā)癥，降低病死率[14]。

黃芪含有黃芪皂苷、多糖、蛋白質(zhì)、黃酮等有效成分，多糖是黃芪的水溶性主要成分之一[4]。APS由阿拉伯糖、木糖、甘露糖、鼠李糖、半乳糖和葡萄糖組成，具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗炎等多種生理功能[5～9]。文獻(xiàn)[15]報(bào)道，APS可抑制胃癌MGC-803細(xì)胞、人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞、人肝癌HepG2細(xì)胞。在胃癌治療上，放療結(jié)合APS治療可明顯減小腫瘤體積[16]。APS治療哮喘可降低痰液細(xì)胞炎癥水平、恢復(fù)肺功能，還能通過調(diào)節(jié)患者免疫功能、減少炎癥反應(yīng)、改善老年患者早期糖尿病腎病的腎功能[17,18]。OJ隨病程進(jìn)展可出現(xiàn)明顯損傷腸道，小腸上段的病理改變可發(fā)現(xiàn)OJ腸黏膜絨毛稀疏、高度減低伴有明顯的水腫且排列紊亂，上皮細(xì)胞部分壞死脫落，可見炎性細(xì)胞浸潤。其次，OJ可導(dǎo)致腸黏膜屏障受損，而血清DAO及I-FABP兩個(gè)指標(biāo)可反應(yīng)腸黏膜屏障功能。OJ 14 d后血清這兩項(xiàng)指標(biāo)要明顯高于對照組。除此之外，OJ影響小腸上皮細(xì)胞再生、促進(jìn)凋亡。PCNA與細(xì)胞DNA合成密切相關(guān)，在細(xì)胞增殖中發(fā)揮重要作用，是細(xì)胞增殖的指標(biāo)，OJ可以使小腸組織PCNA蛋白表達(dá)下降，凋亡增多。

APS干預(yù)后可明顯抑制OJ腸組織促炎因子TNF-α、IL-1β的表達(dá)，上調(diào)促進(jìn)抗炎因子IL-10、IL-Rα的表達(dá)。TNF-α和其他炎性細(xì)胞因子共同作用可引起嚴(yán)重的腸損傷。IL-1β的過表達(dá)參與機(jī)體急性和慢性炎癥反應(yīng)，并且是促進(jìn)其他促炎因子分泌的關(guān)鍵因子[19]。為了進(jìn)一步探究維持這種炎性平衡的可能機(jī)制，我們發(fā)現(xiàn)腸組織TLR4蛋白表達(dá)增高，TLR4介導(dǎo)炎癥反應(yīng)具有重要意義。有研究表明，APS可激活TLR依賴的MyD88信號(hào)通路來調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能[9]，還可通過抑制促凋亡和調(diào)節(jié)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路來減輕IL-1β刺激成纖維滑膜細(xì)胞的促炎作用[20]。Vieira等[21]利用腸上皮細(xì)胞培養(yǎng)模型加入TNF-α細(xì)胞因子可顯著增加一氧化氮、單核細(xì)胞化學(xué)引誘物蛋白1、血管內(nèi)皮生長因子、IL-8、細(xì)胞間黏附分子1和活性氧的含量。TNF-α和其他炎性細(xì)胞因子共同作用可引起嚴(yán)重的腸損傷。IL-1β的過表達(dá)參與機(jī)體急性和慢性炎癥反應(yīng)，并且是促進(jìn)其他促炎因子分泌的關(guān)鍵因子[22]。Sablet等[23]發(fā)現(xiàn)，TNF-α和IL-1β在通過促進(jìn)Ly6c+炎性細(xì)胞增殖和浸潤導(dǎo)致腸道屏障功能損中起關(guān)鍵作用。IL-1Ra具有廣譜抗炎作用。抗炎因子IL-1Ra可通過抑制P53依賴的凋亡，保護(hù)腸隱窩上皮細(xì)胞，減輕腸黏膜炎癥反應(yīng)[24]。本研究在APS干預(yù)后，大鼠小腸組織促炎因子TNF-α、IL-1β水平明顯降低，小腸組織的抗炎因子IL-10、IL-Rα水平顯著升高，可保護(hù)OJ腸功能。

總之，APS可通過TLR4/NF-κB P65通路調(diào)節(jié)小腸促炎與抗炎因子的平衡、減輕OJ大鼠小腸炎癥反應(yīng)、減少細(xì)胞凋亡、維持腸道細(xì)胞增殖活性、降低腸道通透性、保護(hù)腸道功能。