丹參酮ⅡA誘導人胎盤間充質干細胞向心肌細胞分化、提高預分化細胞歸巢能力的研究

樊晨星，王秀艷，趙千，賴紅，李昆

（1.錦州醫科大學附屬第一醫院檢驗科，遼寧 錦州 121001；2.錦州醫科大學附屬第三醫院檢驗科，遼寧 錦州 121001；3.中國醫科大學基礎醫學院解剖學教研室，沈陽 110122）

利用干細胞的分化潛能再生心肌細胞已成為治療缺血性心臟病的一種新策略。由于心肌分化調控的復雜性，無法保證移植入體內的干細胞會向心肌細胞分化的同時不伴有基因突變的發生，因此，移植心肌前體細胞較移植干細胞更為安全有效［1］。目前，人體來源的干細胞定向分化為心肌細胞主要有2種方法，一是通過與異種動物心肌細胞共培養的方法，模擬心肌微環境，促進干細胞向心肌細胞分化［2］；一是通過小分子化合物，如5-氮胞苷等，誘導干細胞向心肌細胞分化［3］。但前者容易將外源性有害基因帶入人體，后者由于劇毒性使其使用劑量受限，導致誘導效率低下。因此，亟需尋找一種更為安全有效的心肌分化誘導劑。丹參酮ⅡA是我國傳統中藥丹參的有效成分，因其具有心血管保護作用，廣泛應用于缺血性心臟病的治療［4］。前期研究［5-7］發現，丹參酮ⅡA能夠誘導人胎盤間充質干細胞（human placenta-derived mesenchymal stem cells，hPDMSCs）向心肌細胞分化，效果優于共培養法和5-氮胞苷誘導法。本研究擬評估丹參酮ⅡA對hPDMSCs向心肌細胞分化及對預分化細胞歸巢能力的影響，并探討其相關機制。

1 材料與方法

1.1 材料

丹參酮ⅡA粉末（20 mg，純度≥98%）購自上海江萊生物科技有限公司；β-catenin激動劑WAY-262611（1 mg粉末，純度≥99.09%）購自上海陶素生化科技有限公司；胎牛血清、DMEM低糖培養基、DMEM高糖培養基和青鏈霉素購自美國Gibco公司；抗心肌轉錄調節因子4（GATA-binding protein 4，GATA-4）、抗心鈉素（atrial natriuretic peptide，ANP）、抗α-橫紋肌肌動蛋白（α-sarcomeric actin，α-SCA）、抗心肌肌鈣蛋白Ⅰ（cardiac troponin I，cTnI）、抗后促進因子（anaphase promoting factor，APC）、抗糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase-3β，Gsk-3β）、抗β-catenin、抗CXC趨化因子受體4（CXC chemokine receptor 4，CXCR-4）、抗CC趨化因子受體2（CC chemokine receptor 2，CCR-2）購自美國Abcam公 司；抗CD13、抗CD73、抗CD90、抗CD166、抗人白細胞抗原DR（human leukocyte antigen DR，HLADR）、抗CD14、抗CD29、抗CD31、抗CD44、抗CD45、抗CD105、抗人白細胞抗原ABC（human leukocyte antigen ABC，HLA-ABC）抗體均購自美國BD Biosciences公司；SDS-PAGE凝膠試劑盒、ECL超敏化學發光顯影液等購自北京碧云天科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 hPDMSCs的分離鑒定：采用組織塊分離法培養hPDMSCs［5］。取第3代細胞，待其長滿培養皿底部后，用胰酶消化處理，PBS洗滌2次，計數1×106細胞置于樣品管中，分別加入FITC標記的鼠抗人的HLAABC、CD29、CD31、CD44、CD45、CD14、CD105抗體和PE標記的鼠抗人HLA-DR、CD13、CD73、CD90、CD166抗體，4 ℃避光孵育20 min，同時設置空白對照組，流式細胞儀檢測細胞上述抗原的表達情況。

1.2.2 細胞培養：前期研究［7］顯示，0.1 mg/L丹參酮ⅡA對hPDMSCs沒有細胞毒性，且誘導hPDMSC向心肌細胞分化的效果優于丹參，故仍然選擇0.1 mg/L丹參酮ⅡA用于本研究。將hPDMSCs分別接種于96孔板和10 cm培養皿中（1×103/cm2），用含10%胎牛血清和1%青鏈霉素的DMEM培養；次日，分別加入0.1 mg/L丹參酮ⅡA或0.1 mg/L丹參酮ⅡA+0.1 μmol/L β-catenin激動劑WAY-262611，同時設置不加藥的對照組，每4 d換液1次，3-（4，5-二甲基吡啶-2-基）-5-（3-羧基甲氧基苯基）-2-（4-磺苯基）-2H-四唑［3（-4，5-dimethylthiazol-2-yl）-5（-3-carboxymethoxyphenyl）-2-（4-sulfophenyl）-2H-tetrazolium，MTS］法檢測細胞的增殖情況，20 d終止實驗，收集細胞進行Western blotting檢測。

1.2.3 劃痕實驗：將hPDMSCs接種于6孔板中（1.5×103/cm2），用含10%胎牛血清和1%青鏈霉素的DMEM培養；次日，分別加入0.1 mg/L丹參酮ⅡA或0.1 mg/L丹參酮ⅡA+0.1 μmol/L β-catenin激動劑WAY-262611，同時設置不加藥的對照組，每4 d換液1次。培養2周后，用200 μL的槍頭做十字劃痕，吸去完全培養基，更換為含0.5%胎牛血清的DMEM培養［8］，分別用0.1 mg/L丹參酮ⅡA、0.1 mg/L丹參酮ⅡA+0.1 μmol/L β-catenin激動劑WAY-262611干預24 h后，于顯微鏡下拍照，觀察相同部位細胞向損傷區遷移的情況。

1.2.4 Western blotting：收集細胞于EP管中，加入裂解液，-20 ℃過夜；渦旋裂解，4 ℃、12 000 r/min離心25 min，收集總蛋白并定量；加入等量蛋白并進行SDS-PAGE電泳，轉膜，封閉，加入抗GAPDH、抗GATA-4、抗ANP、抗α-SCA、抗cTnI、抗APC、抗Gsk-3β、抗β-catenin、抗CXCR-4、抗CCR-2抗體，4 ℃孵育過夜；洗膜后加入HRP標記的二抗，室溫孵育1 h；超敏化學發光顯影液顯色，自動電泳凝膠成像儀采集圖像，檢測灰度值，以目的蛋白與GAPDH條帶灰度值的比值表示目的蛋白表達水平。

1.3 統計學分析

采用SPSS 16.0統計軟件進行統計學分析。蛋白表達水平均符合正態分布，采用表示，采用t檢驗比較組間差異，P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 hPDMSCs的提取與鑒定

分離培養3～5 d時，組織塊周圍有少量呈短梭形、形態飽滿的細胞爬出；隨著細胞不斷向外擴增，逐漸變成長梭形并形成細胞集落；第3周時，細胞達80%～90%融合；經傳代貼壁后，細胞重新變成長梭形并形成細胞集落（圖1A）。流式細胞儀結果顯示，來源人胎盤組織的第3代細胞，表達CD13、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD166、HLA-ABC，不 表達CD14、CD31、CD45、HLA-DR（圖1B），呈現間充質干細胞的表面標記特性。

2.2 丹參酮ⅡA干預對hPDMSCs的增殖及形態的影響

如圖2所示，培養12 d內，對照組細胞增殖速度較快，隨后由于細胞密度較大而出現接觸性抑制，增殖減慢，整個過程中細胞始終保持成纖維細胞樣形態。與對照組相比，丹參酮ⅡA干預組細胞長勢緩慢，部分細胞逐漸增大并形成棒狀外觀，且細胞間出現很多連接細胞的分支。

2.3 丹參酮ⅡA干預對心肌特異性蛋白GATA-4、ANP、α-SCA、cTnI表達及預分化細胞向損傷區遷移能力的影響

如圖3所示，與對照組比較，丹參酮ⅡA組細胞心肌特異性蛋白GATA-4、ANP、α-SCA、cTnI的表達明顯增多（P＜ 0.05），且向損傷區遷移的能力明顯增強（P＜ 0.05）。

2.4 丹參酮ⅡA干預對Wnt/β-catenin通路中相關蛋白APC、Gsk-3β、β-catenin及與歸巢相關的趨化因子CXCR-4、CCR-2表達的影響

圖3 丹參酮ⅡA干預前后心肌特異性蛋白的表達變化及預分化細胞向損傷區遷移的情況Fig.3 Changes of myocardial specific protein expression and migration of pre-differentiated cells to the injured area before and after tanshinone ⅡA intervention

如圖4所示，與對照組比較，丹參酮ⅡA組干預細胞APC、Gsk-3β、CXCR-4、CCR-2的表達明顯增多（P＜ 0.05），β-catenin的表達明顯減少（P＜ 0.05）。

2.5 β-catenin激動劑WAY-262611對丹參酮ⅡA誘導hPDMSCs向心肌分化、提高預分化細胞向損傷區歸巢能力的影響

經β-catenin激動劑WAY-262611干預后，丹參酮ⅡA組干預細胞β-catenin表達明顯增多（P＜ 0.05）（圖5A），說明β-catenin激動劑WAY-262611干預有效；雖然丹參酮ⅡA能夠抑制細胞增殖，促進細胞心肌樣形態改變，但經β-catenin激動劑WAY-262611干預后，細胞的增殖速度明顯增快，且呈長梭形集落狀生長（圖5B、5C）；與丹參酮ⅡA干預組相比，丹參酮ⅡA+β-catenin激動劑WAY-262611干預組細胞心肌特異性蛋白GATA-4、ANP、α-SCA、cTnI的表達明顯減少（P＜ 0.05）（圖5D），且細胞向損傷區遷移的能力明顯下降（圖5E），與細胞歸巢相關的趨化因子CXCR-4、CCR-2的表達也明顯減少（P＜ 0.05）（圖5F）。

圖4 丹參酮ⅡA干預前后Wnt/β-catenin通路中相關蛋白及與歸巢相關的趨化因子的表達變化情況Fig.4 Expressions of the related proteins in Wnt/β-catenin pathway and the homing-related chemokines before and after intervention with tanshinone ⅡA

3 討論

胎盤中存在大量易于提取分離的間充質干細胞，這些細胞能表達某些胚胎干細胞的表面標志物，提示hPDMSCs具有很強的自我更新和分化能力；而且，hPDMSCs不僅免疫原性較低，還具有免疫調節特性［9］。因此，hPDMSCs在同種同體及同種異體移植治療中具有廣闊的應用前景。

缺血性心臟病所導致的心肌細胞不可逆的死亡是心功能不全的主要原因。盡管溶栓、介入和冠狀動脈旁路搭橋等血運重建技術能夠改善冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的缺血狀態，但卻不能彌補損失的心肌細胞。利用干細胞增殖分化潛能，再生心肌細胞，修復受損心肌組織，恢復心臟功能，已成為治療缺血性心臟病的一種新策略。但由于心肌分化調控的復雜性，還不能保證移植入體內的干細胞會向心肌細胞分化的同時不伴有基因突變的發生，因此，移植心肌前體細胞較移植干細胞更為安全有效［1］。在眾多誘導干細胞向心肌前體細胞分化的方式中，共培養法和5-氮胞苷誘導法最為常用。但是，這2種方法都存在不足，尚不能廣泛應用于臨床上的心肌再生。另外，在干細胞通過再生心肌細胞修復受損心肌組織的過程中，除被移植的干細胞能否分化為心肌細胞外，另一個制約心肌再生和修復的因素是分化細胞向損傷區歸巢（即遷移運動）的能力。

心臟由中胚層發育而來，其形成和發育過程十分復雜，涉及眾多信號通路的參與，其中，Wnt/β-catenin通路發揮著不可替代的作用。研究［10-11］顯示，在中胚層形成以后，抑制Wnt/β-catenin通路可以完全并有效地指定中胚層細胞向心肌細胞分化。此外，Wnt/β-catenin通路也參與細胞遷移運動能力的調控。細胞的遷移運動能力涉及趨化因子、生長因子、黏附分子等的參與［12-14］。本研究結果顯示，經丹參酮ⅡA干預后，hPDMSCs的增殖速度明顯減慢，心肌特異性蛋白GATA-4、ANP、α-SCA、cTnI的表達明顯增加；在這一過程中，Wnt/β-catenin通路中的APC、Gsk-3β的表達明顯增加，β-catenin明顯減少，預分化細胞向損傷區遷移運動的能力明顯增強，和與歸巢相關的趨化因子CXCR-4、CCR-2的表達增加一致。因此，推測丹參酮ⅡA通過調控Wnt/β-catenin通路誘導hPDMSCs向心肌細胞分化，提高預分化細胞歸巢能力。為了進一步驗證這一推測，本研究應用β-catenin激動劑WAY-262611干預了丹參酮ⅡA誘導分化體系，結果顯示，β-catenin激動劑WAY-262611干預后，細胞生長速度明顯增快，與單獨丹參酮ⅡA干預相比，丹參酮ⅡA+β-catenin激動劑WAY-262611干預后，心肌特異性蛋白GATA-4、ANP、α-SCA、cTnI的表達明顯減少，細胞遷移明顯受到抑制，與歸巢相關的趨化因子CXCR-4、CCR-2的表達也明顯減少。

圖5 β-catenin激動劑WAY-262611干預前后β-catenin蛋白、細胞增殖形態、心肌特異性蛋白、預分化細胞向損傷區遷移及與歸巢相關的趨化因子表達變化的情況Fig.5 Changes in β-catenin expression，cell proliferation，cell morphology，cardiac-specific proteins，migration of pre-differentiated cells to the injured area，and the expression of homing-related chemokines before and after intervention with the β -catenin agonist WAY-262611

綜上所述，本研究發現，丹參酮ⅡA能誘導hPDMSCs向心肌細胞分化，提高預分化細胞的歸巢能力，其機制與丹參酮ⅡA調控Wnt/β-catenin通路有關。