胞外信號調節激酶通路活化促進?？颂婺崮退幍姆切〖毎伟┣忠u和轉移

楊旸，王一喆，鄭春雷，侯科佐，王曉楠，胡雪君

（中國醫科大學附屬第一醫院 1.老年呼吸感染科；2.腫瘤內科，遼寧省抗腫瘤藥物與生物治療重點實驗室，沈陽 110001）

肺癌的發病率和死亡率在我國乃至世界范圍內均居惡性腫瘤之首，其中非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）約占所有類型肺癌的85%。由于缺乏早期臨床表現，40%的NSCLC發現時已經轉移（Ⅳ期），晚期NSCLC是癌癥相關死亡的主要原因。傳統的以鉑類為基礎的治療方案對NSCLC的療效目前已達到平臺期，隨著對癌癥相關基因及通路的進一步深入研究，表皮生長因子受體-酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI）成為晚期NSCLC的主要治療手段。EGFR-TKI能夠顯著延長EGFR突變的NSCLC患者的無進展生存期，并改善患者生活質量。埃克替尼是口服選擇性EGFR-TKI，是我國第一個擁有自主知識產權的EGFR-TKI，也是全球第3個上市的EGFR-TKI。2011年6月被美國食品藥品監督管理局批準用于晚期NSCLC的治療。在NSCLC的治療中，埃克替尼發揮了良好的抗腫瘤作用［1］，尤其對晚期NSCLC復發的療效良好。目前，埃克替尼已成為中國治療晚期NSCLC的標準藥物之一［2］。

雖然EGFR-TKI在NSCLC中療效顯著，但接受靶向治療的患者經過10～14個月無進展生存期后大多數還是會出現耐藥和腫瘤復發。因此，深入探討EGFR-TKI耐藥肺癌細胞的生物學特性，對于理解耐藥機制及探索新的耐藥逆轉策略具有重要意義。研究報道，化療藥物和TKI等靶向藥物耐藥后，腫瘤細胞的轉移能力增強［3-4］，其機制與上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）表型和細胞干性增強相關［5］。然而，埃克替尼耐藥細胞的轉移能力是否增強以及其促轉移機制目前尚不十分明確。研究［6-9］表明，在TKI耐藥的NSCLC、慢性粒細胞白血病和黑色素瘤中均存在胞外信號調節激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）通路持續活化。在EGFR-TKI耐藥的NSCLC細胞中，抑制ERK通路可以有效逆轉耐藥［6］。然而，關于ERK通路是否促進埃克替尼耐藥的肺癌細胞轉移的研究甚少。本研究探討了NSCLC中ERK通路活化對?？颂婺崮退幖毎w移和侵襲能力的影響，旨在為逆轉EGFRTKI耐藥提供新的可能途徑。

1 材料與方法

1.1 試劑

?？颂婺嵊烧憬愡_藥業提供，PD98059、EGFR、phosph-EGFR、ERK、phosph-ERK抗體購自美國Cell Signaling Technology公司，RPMI 1640培養基購自美國Gibco公司，β-actin抗體購自美國Santa Cruz公司。

1.2 細胞培養與耐藥細胞系建立

人肺腺癌細胞株PC9和PC9/IcoR培養于含10%胎牛血清（以色列Biological Industries公司）、1%青霉素和鏈霉素的RPMI 1640培養基，培養箱條件為5%CO2、37 ℃恒溫。PC9細胞株購自中科院上海細胞庫。耐藥細胞株PC9/IcoR的獲得：使PC9細胞株持續暴露于初始濃度為0.05 μmol/L的?？颂婺嶂?，逐漸增加藥物濃度，直到藥物濃度達到10 μmol/L，篩選此時穩定存活的細胞。PC9和PC9/IcoR細胞株每2～3 d傳代1次，取對數生長期細胞用于后續實驗。

1.3 MTT檢測細胞增殖能力

采用MTT比色法測定?？颂婺釋毎盍Φ挠绊?，將PC9和PC9/IcoR細胞以3 000/孔的密度接種于96孔板，培養至細胞貼壁后加入不同濃度（0、0.1、1、10和20 μmol/L）的?？颂婺崂^續培養96 h。檢測ERK通路對PC9/IcoR細胞活力的影響，分別用不同濃度（0、10、20和40 μmol/L）的ERK通路抑制劑PD98059（PD98059組）以及上述濃度的PD98059與10 μmol/L?？颂婺崧摵希▋伤幝撚媒M）作用細胞24 h，每個藥物濃度設置4個復孔并設置對照孔。之后每孔加入20 μL MTT（5 g/L），繼續培養4 h后吸棄上清，加入DMSO 200 μL/孔，震蕩15～20 min。酶標儀檢測570 nm波長的吸光度值，計算藥物作用下的細胞活力。

1.4 Transwell遷移實驗檢測細胞遷移能力

采用孔徑為8 μm的Transwell小室和配套的24孔板。將對數生長期的PC9和PC9/IcoR細胞消化并用PBS清洗后，用無血清培養基懸浮細胞，調整細胞濃度，制備上室細胞懸液200 μL（3.0×104個細胞），下室加入2.5%血清的培養基500μ L。檢測ERK通路對PC9/IcoR細胞遷移能力的影響，分別用10 μmol/L的?？颂婺幔ò？颂婺峤M）、20 μmol/L的PD98059（PD98059組）和兩藥聯合（兩藥聯用組）預處理細胞4 h，并設置對照組。分別于上室和下室加入相應濃度的藥物，常規培養24 h后，棄去小室中培養液清洗并風干，瑞氏-吉姆薩染色法染色固定。顯微鏡下觀察拍照，每個小室隨機選取3個視野計數，每個實驗至少重復3次。

1.5 基質膠侵襲實驗檢測細胞侵襲能力

將基質膠與RPMI 1640培養基以1 ∶30比例稀釋后，鋪于小室中，置于37 ℃培養箱中30～40 min使其凝固。將PC9和PC9/IcoR細胞胰蛋白酶消化并用PBS洗滌后，以3.0×104/孔接種于Transwell小室的上室，終體積200 μL。下室加入含2.5%血清的RPMI 1640培養液，終體積500 μL。檢測ERK通路對PC9/IcoR細胞侵襲能力的影響，分別用10 μmol/L的?？颂婺幔ò？颂婺峤M）、20 μmol/L的PD98059（PD98059組）和兩藥聯合（兩藥聯用組）預處理細胞4 h，并設置對照組。分別于上室和下室加入相應濃度的藥物，24孔板于培養箱中培養24 h，清洗風干后用瑞氏-吉姆薩染色法染色固定45 min～1 h。再次清洗晾干后于顯微鏡下觀察，每個小室隨機選取3個視野拍照、計數。

1.6 Western blotting檢測細胞蛋白表達

將PC9和PC9/IcoR細胞冰上裂解，裂解后的細胞懸液于4 ℃超聲離心后取上清，BCA法測定蛋白濃度。檢測ERK通路對PC9/IcoR細胞蛋白表達的影響，分別用10 μmol/L的?？颂婺幔ò？颂婺峤M）、20 μmol/L的PD98059（PD98059組）和兩藥聯合（兩藥聯用組）作用細胞24 h再收集細胞蛋白，并設置對照組。定量后取20～40 μg蛋白在聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳，并濕法轉印到PVDF膜上。室溫下5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1 h，加入相應的一抗于4 ℃過夜。1×PBS清洗一抗4次后，加入二抗室溫封閉30～40 min，再用PBS清洗4次并顯像分析。

1.7 統計學分析

采用SPSS 16.0軟件進行數據分析。數據均為3次獨立實驗結果，用表示，2組間比較采用t檢驗，P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 埃克替尼對細胞增殖能力的影響

MTT實驗驗證?？颂婺釋C9和PC9/IcoR細胞的增殖抑制作用。結果顯示，埃克替尼作用96 h后，不同濃度（0.1、1、10、20 μmol/L）的?？颂婺峋鶎C9細胞產生增殖抑制作用，且增殖抑制作用隨著?？颂婺釢舛鹊脑黾佣黾?，與PC9/IcoR細胞比較差異有統計學意義（均P＜ 0.05），而在?？颂婺嶙饔孟翽C9/IcoR細胞的增殖未受到明顯抑制。見圖1。結果提示，PC9/IcoR細胞具有較強且較穩定的埃克替尼耐藥特性。

圖1 ?？颂婺釋C9和PC9/IcoR細胞增殖能力的影響Fig.1 Effect of icotinib on the proliferation of PC9 and PC9/IcoR cells

2.2 PC9和PC9/IcoR細胞遷移和侵襲能力的比較

Transwell小室法檢測PC9和PC9/IcoR細胞的遷移和侵襲能力。結果顯示，24 h后穿過小室和基質膠的PC9/IcoR細胞數量明顯多于PC9細胞（24 h PC9與PC9/IcoR細胞的增殖能力并無明顯差異），差異有統計學意義（P＜ 0.05）。結果提示，與親本細胞PC9相比，耐藥細胞PC9/IcoR具有更強的遷移和侵襲能力。見圖2。

2.3 PC9和PC9/IcoR細胞中蛋白的表達情況

圖2 PC9和PC9/IcoR細胞遷移和侵襲能力的比較Fig.2 Comparison of the migration and invasion abilities between PC9 and PC9/IcoR cells

Western blotting檢測PC9和PC9/IcoR細胞中ERK、phosph-ERK、EGFR、phosph-EGFR蛋白的表達水平。PC9細胞雖然均有一定程度的EGFR和ERK磷酸化（phosph-EGFR、phosph-ERK），但是PC9/IcoR細胞中phosph-EGFR和phosph-ERK水平明顯升高。見圖3。由此可見，ERK通路活化可能與耐藥細胞侵襲和轉移能力增強相關。

圖3 PC9和PC9/IcoR細胞的蛋白表達Fig.3 The expression of proteins in PC9 and PC9/IcoR cells

2.4 PD98059對PC9/IcoR細胞增殖能力和ERK通路的影響

Western blotting結果顯示，PD98059組phosph-ERK蛋白表達水平明顯降低，兩藥聯用組phosph-ERK蛋白下調最明顯（P＜ 0.05，圖4A）。MTT結果顯示，無論在何種藥物濃度作用下，PD98059組和兩藥聯用組細胞增殖能力均無明顯下降（P＞ 0.05，圖4B）。結果提示，ERK通路對PC9/IcoR細胞增殖無影響。

2.5 抑制ERK通路對PC9/IcoR細胞遷移和侵襲能力的影響

與對照組相比，?？颂婺峤M穿過小室及基質膠的細胞數量未見明顯變化，結果均無統計學差異（P＞0.05）；PD98059組遷移和侵襲的細胞數量明顯減少，差異均有統計學意義（P＜ 0.05）；兩藥聯用組細胞遷移和侵襲能力被抑制最為明顯，差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。結果提示，ERK通路活化促進PC9/IcoR細胞的遷移和侵襲。見圖5。

圖4 抑制ERK對PC9/IcoR細胞增殖和蛋白表達的影響Fig.4 Effect of ERK inhibition on the proliferation and protein expression of PC9/IcoR cells

3 討論

雖然EGFR-TKI可以明顯提高EGFR突變的NSCLC患者的生存率，耐藥仍然是治療中的主要障礙。常見的耐藥機制包括T790M突變、MET擴增、胰島素樣生長因子1受體通路激活等。現有研究［10］顯示，EGFR-TKI耐藥的肺腺癌細胞除對TKI的敏感性降低之外，還獲得了更強的侵襲和遷移能力。進一步的機制研究表明，EMT、EGF通路激活和MET擴增均促進了EGFR-TKI耐藥NSCLC的遷移和侵襲。本研究結果與既往研究一致，與PC9細胞系相比，PC9/IcoR耐藥細胞系遷移和侵襲能力明顯增強，提示腫瘤細胞的遷移和侵襲是埃克替尼耐藥的特征之一。

ERK通路是調節細胞增殖、存活、分化和運動的主要微環境調節級聯信號通路之一，在人類腫瘤中常被激活。在某些情況下，ERK通路活化可以刺激正常組織細胞的增殖和運動失控進而向惡性轉化。目前已有多項研究報道，在TKI耐藥的腫瘤細胞中存在ERK通路的持續活化。HANLY等［11］的研究表明，維羅非尼耐藥的甲狀腺乳頭狀癌細胞中ERK過度活化。伊馬替尼耐藥的慢性粒細胞白血病中存在ERK通路持續活化，吉非替尼耐藥的NSCLC中ERK通路過度活化［12］。JANMAAT等［13］報道了吉非替尼耐藥的NSCLC細胞系中存在EGFR非依賴性Ras/ERK通路持續活化。本研究結果顯示，PC9/IcoR耐藥細胞中ERK磷酸化水平明顯高于PC9細胞，提示耐藥細胞中ERK通路活化程度更高，與上述研究結果一致。

圖5 抑制ERK對PC9/IcoR細胞遷移和侵襲的影響Fig.5 Effect of ERK inhibition on the migration and invasion abilities of PC9/IcoR cells

除在TKI耐藥的腫瘤中持續活化外，ERK通路還可以調控腫瘤的轉移。研究［14］顯示，ERK通路的激活在乳腺癌細胞的侵襲和轉移中發揮重要作用。在胃癌中抑制MAPK/ERK信號通路可以阻止腫瘤細胞的遷移和侵襲［15］。2017年的一項研究［16］表明，在PD-L1/BAG-1高表達的NSCLC患者中，聯合應用TKI與ERK抑制劑可以克服PD-L1介導的腫瘤侵襲和TKI抗性。由于在PC9/IcoR耐藥細胞系中ERK活化與細胞遷移和侵襲能力增強變化趨勢一致，本研究采用PD98059作用于PC9/IcoR細胞后，觀察細胞遷移和侵襲能力的變化，進一步探究兩者之間是否存在關聯。結果顯示，在不影響細胞增殖情況下，ERK活性被抑制后，PC9/IcoR細胞遷移和侵襲能力明顯下降，當PD98059與?？颂婺崧撚脮r，細胞遷移和侵襲能力被抑制最明顯。由此可見，在?？颂婺崮退幍腘SCLC中，ERK通路活化促進耐藥細胞的遷移和侵襲。

綜上所述，本研究明確了ERK通路活化與EGFR-TKI耐藥細胞遷移和侵襲之間的關聯。研究結果提示，在EGFR-TKI耐藥的NSCLC中，抑制ERK通路可以抑制腫瘤的侵襲和轉移，也為逆轉TKI耐藥提供新的思路，可在臨床治療中試驗性應用。