缺氧缺血致腦室周圍白質軟化新生大鼠連接蛋白47表達及其對少突膠質細胞髓鞘化的影響

侯阿娜，曲雙雙，富建華

（1.中國醫科大學附屬盛京醫院兒科，沈陽 110004；2.北部戰區總醫院兒科，沈陽 110016）

近年來，極低和超低出生體質量嬰兒的存活率明顯提高，但隨之而來的腦室周圍白質軟化（periventricular leukomalacia，PVL）發病率居高不下［1］。PVL作為早產兒腦白質損傷的最嚴重形式，已成為影響低出生體質量嬰兒日后生存質量的主要疾病。我國研究［2］結果顯示早產兒PVL發生率為8%～26%，在極低出生體質量嬰兒中PVL發生率為5%～17%，其中74.2%以上發生腦癱。PVL的病因較為復雜，目前研究［3-6］認為與缺氧缺血（hypoxia ischemia，HI）、全身感染和炎癥反應、小膠質細胞活化、興奮性毒性、自由基損害以及大腦白質少突膠質細胞（oligodendrocytes，OLs）自身的發育易損性等有關。而HI始終被認為是其發病的主要原因，其病理學基礎為OLs彌漫性損傷伴髓鞘形成障礙［7-8］。

連接蛋白47（connexin 47，Cx47）是縫隙連接蛋白家族的一員，可通過縫隙連接通道直接介導細胞間縫隙連接通道（gap junctional intercellular communication，GJIC），參與并影響細胞死亡過程［9］。Cx47被證實可形成Cx47/Cx47和Cx47/Cx43等功能性縫隙連接，促使細胞間營養物質、離子、第二信使及小分子（約1×103）等通過，在中樞神經系統髓鞘的形成和損傷修復中起到關鍵的作用［10］。Cx47缺乏可引起遺傳性脫髓鞘疾病［11-13］。PARENTI等［12］通過實驗證實Cx47廣泛存在于OLs和髓鞘當中，既在髓鞘形成早期的發展過程中，也參與新髓鞘的形成，且在脫髓鞘后髓鞘再生的恢復階段表達被上調。由于PVL的晚期病理結局主要為OLs彌漫性損傷伴髓鞘形成障礙，Cx47是否參與此階段的髓鞘損傷及修復，目前尚不清楚。因此，本研究在建立HI致PVL模型的基礎上，動態監測Cx47的表達變化，旨在闡明Cx47是否與PVL髓鞘的損傷及修復相關。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及模型制備

健康清潔級3日齡SD大鼠120只（中國醫科大學附屬盛京醫院實驗中心提供），隨機均分為HI組（n=60）、對照組（n=60），雌雄不限。按本課題組以往PVL動物模型建立方法［14］，將3日齡SD大鼠吸入性乙醚麻醉，仰臥位顯微鏡下固定，碘伏消毒后，在頸部緊貼氣管右側切縱形切口（0.5～1.0 cm），分離并用7/0一次性縫合線結扎右側頸總動脈，在結扎的兩端之間將動脈剪斷，防止結扎線脫落缺血不徹底，縫合切口，表皮用生理鹽水清洗干凈（手術時間＜5 min），術后將新生鼠放入恒溫低氧箱2 h（92%氮氣和8%氧氣混合氣體）；然后返回母鼠身邊飼養。對照組僅分離右側頸總動脈，不結扎也不暴露于低氧中。

1.2 標本采集及制備

2組分別于術后1、3、7、14 d處死大鼠，每個時間分別處死15只。乙醚吸入麻醉后，0.9%生理鹽水左心室灌注，4% 多聚甲醛溶液固定，斷頭取腦，以視交叉為中心前后2 mm取腦組織。分別用于 HE染色、透射電鏡分析、免疫組化和免疫熒光觀察、Western blotting和實時PCR檢測。

1.3 實驗方法

1.3.1 HE染色觀察腦組織形態：取各時間點腦組織后，4%多聚甲醛固定、梯度乙醇脫水、浸蠟、包埋，連續冠狀切片，片厚4.5 μm。二甲苯、乙醇梯度脫蠟后進行HE染色，每組各時間點隨機抽取6張，每張切片光鏡下（×400）隨機選取5個腦室周圍腦白質視野觀察病理改變。

1.3.2 透射電鏡觀察OLs間縫隙連接超微結構：對照組及HI組大鼠各2只，10%水合氯醛腹腔注射麻醉（3 mL/kg）后迅速斷頭取腦，選取腦組織右側白質（1 mm3），置于 2.5%戊二醛 4 ℃保存。1%鋨酸 4 ℃下固定24 h后，用 30%～100%濃度丙酮梯度脫水，環氧樹脂包埋，超薄切片機切片（片厚約50 μm）。切片用醋酸雙氧鈾及硝酸鉛雙重染色后，在JEM-1200Ex透射電鏡（日本Hitachi Electronic公司）下識別具有特殊超微結構特征的OLs及其縫隙連接，觀察OLs間縫隙連接狀態的超微結構。

1.3.3 免疫組化檢測Cx47、髓鞘堿性蛋白（myelin basic protein，MBP）表達及定位：腦組織石蠟切片常規脫蠟后，3%過氧化氫溶液室溫處理20 min；標準檸檬酸緩沖液進行微波修復；山羊血清室溫封閉30 min；滴加一抗（Cx47 1 ∶200，兔抗大鼠抗體購自美國Santa Cruz公司；MBP 1 ∶300稀釋，兔抗大鼠抗體購自美國Abcam公司）4 ℃過夜；陰性對照以PBS替代一抗。0.01 mol/L PBS洗滌，滴加生物素標記的羊抗兔IgG（免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司），37 ℃30 min；辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素37 ℃30 min；DAB顯色（北京中杉金橋生物技術公司），蘇木精復染，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。利用美國 Universal Imaging Porporation圖像分析系統，應用MetaMorph軟件，測定平均光強度以表示陽性產物的強度。同時采用連續切片方法雙標Cx47及MBP，進而實現Cx47及MBP的共定位。

1.3.4 Western blotting測定Cx47、MBP蛋白表達水平：按照文獻［15］方法，取右側腦組織50～80 mg，提取蛋白，并采用BCA法測定蛋白濃度。加入細胞裂解液及緩沖液，加熱變性。各標本蛋白（20 μL）上樣，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS -PAGE），轉印，Tris鹽酸緩沖液（TBST）漂洗，脫脂奶粉封閉2 h，TBST清洗3次，每次10 min，加一抗Cx47（1 ∶800）、MBP（1 ∶1 000），4 ℃過夜，陰性對照加TBST代替一抗。TBST洗3次，每次10 min，二抗（山羊抗兔1 ∶2 000；山羊抗小鼠 1：2 000購自北京中山金橋生物技術有限公司）工作濃度1 ∶2 000室溫孵育2 h，TBST洗 膜3次，每 次10 min，GAPDH做內參各組進行對比。最后進行化學發光（ECL kit；Santa Cruz Biotechnology）顯色。結果用凝膠圖像分析系統（Chemi Imager 5500 V2.03軟件）進行吸光度掃描分析，并用圖像分析系統（Fluor Chen 2.0軟件）對掃描圖像進行分析。腦組織內的蛋白用平均灰度值表示，蛋白灰度值越高表示蛋白含量越高。

1.3.5 實時PCR方法測定Cx47、MBP基因表達：應用Trizol-丙酮沉淀法提取RNA，按TaKaRa反轉錄試劑盒說明反轉錄合成cDNA［15］。引物由上海生工公司設計并合成，見表1。采用TaKaRa實時-染料法（20 μL體系）進行定量PCR擴增。Cx47mRNA的相對表達量應用2-ΔΔCt法進行計算。

1.4 統計學分析

表1 實時PCR測定基因表達引物列表Tab.1 RT-PCR primer sequences

2 結果

2.1 一般狀態及行為改變

對照組大鼠一般狀態反應良好，吃奶好，膚色紅潤，生長發育迅速。而HI組逐漸出現狀態反應差、周身循環不良、皮膚發紺、蒼白等表現，隨著低氧時間延長皮膚蒼白逐漸加重，繼而出現煩躁不安，激惹，有時可見四肢抽搐，最終出現嗜睡、大小便失禁等表現，恢復喂養后癥狀緩解。但隨生長發育時間的延長，HI組出現明顯活動減少、運動不協調、睜眼障礙及生長發育延遲等表現。

2.2 形態學變化

光鏡下，對照組腦組織形態結構正常，細胞分布均勻、排列緊密有序，細胞結構完整，核圓形、淡染，染色清晰，隨著大鼠日齡的增加細胞逐漸成熟變大，細胞形態更加完整清晰（圖1A、1B、1C、1D）。HI組1 d腦白質內膠質細胞間隙增寬，細胞變形，排列紊亂，少量細胞出現核固縮（圖1E），手術后3 d膠質細胞大量壞死，并伴有腦白質廣泛結構疏松、紊亂，可呈篩網狀壞死，形成空洞等（圖1F）。與手術后 3 d比較，手術后7、14 d溶解壞死細胞逐漸修復，腦白質病變及壞死區域明顯減輕，篩網狀損傷基本消失，取而代之的是條索狀、點狀及囊性壞死，最終形成軟化灶（圖1G、1H）。

2.3 腦組織縫隙連接超微結構變化

對照組可見到OLs形態結構完整，細胞膜及核膜明顯，胞核大而清晰，核內染色質豐富且分布均勻。OLs通過致密的縫隙連接直接相連（圖2A）。與對照組比較，HI組OLs形態極其不規則，結構明顯異常，隨損傷加重大量細胞溶解壞死，細胞核結構甚至消失，核染色質濃縮、異染，細胞間縫隙連接斷裂不連續（圖2B）。

2.4 免疫組化檢測腦組織內蛋白的表達

圖1 各組腦組織形態學改變 HE× 400Fig.1 Morphological changes in brain tissue in each group HE× 400

圖2 透射電鏡下觀察HI對少突膠質細胞間縫隙連接通道的影響× 8 000Fig.2 The effect of HI on oligodendrocyte gap junctions observed under a transmission electron microscope × 8 000

2.4.1 免疫組化檢測腦組織內Cx47的表達：對照組手術后1 d Cx47在腦組織中即有表達，并隨日齡增加染色呈大量棕黃色（圖3A、3B、3C、3D），隨著日齡增加Cx47表達量也增加；HI組手術后1、3、7、14 d腦組織中Cx47表達雖呈上升趨勢，但相同時間點的表達均較對照組明顯減少。手術后3、7 d Cx47的表達減少尤為明顯（圖3F、3G）；而在14 d 2組Cx47表達差異開始縮小（圖3H）。

圖3 免疫組化檢測腦組織內Cx47的表達× 200Fig.3 Immunohistochemical analysis of Cx47 expression in brain tissue × 200

2.4.2 免疫組化MBP的定位及表達：對照組及HI組手術后1 d腦室周圍白質MBP陽性細胞表達較少，隨著日齡的增加其表達升高。14 d時MBP廣泛表達于OLs胞質及軸突突起上，半定量結果顯示HI組MBP的表達較對照組降低，差異具有統計學意義（P＜0.05）。對照組手術后1、14 d腦組織MBP表達隨著日齡增加而增加，由1 d的胞質表達到14 d的廣泛細胞間隙突起的表達。HI組MBP的表達趨勢與對照組相同，但相同時間點較對照組表達降低，HI組細胞突起明顯減少。見圖4。

2.5 新生大鼠腦組織中Cx47蛋白表達（表2、圖5）

通過Western blotting檢測腦組織中Cx47的蛋白表達水平，發現Cx47蛋白表達在對照組及HI組均隨著日齡的增長逐步增加（P＜ 0.01）。但2組間比較，HI組手術后3、7、14 dCx47蛋白水平較對照組明顯減少（P＜ 0.01）。

圖4 免疫組化定位MBP的表達× 200Fig.4 Immunohistochemical detection of MBP expression × 200

表2 2組Cx47蛋白和mRNA表達水平比較Tab.2 The expression levels of Cx47 protein and mRNA in the two groups

圖5 各組手術后腦組織Cx47蛋白表達Fig.5 Expression of Cx47 protein in brain tissue after surgery

2.6 腦組織Cx47基因表達水平

實時PCR檢測腦組織Cx47mRNA表達水平，發現對照組和HI組在術后第1天即出現Cx47mRNA表達，并隨著日齡增加Cx47mRNA水平逐漸增加（P＜0.01）。對照組Cx47mRNA出現高表達先快后慢，直到術后14 d達到高峰（P＜ 0.01）。2組間比較，HI組Cx47mRNA的表達水平在1、3、7、14 d均較對照組明顯降低（均P＜ 0.01）。見表2。

3 討論

OLs的主要功能是包繞軸突、形成絕緣的髓鞘結構、協助神經電信號的跳躍式高效傳遞，維持和保護神經元的正常功能。而PVL的主要病理改變就是OLs的彌漫性損傷伴髓鞘形成障礙［12］，OLs對HI高度敏感，HI時未成熟OLs易受到氧化應激等損傷，導致其壞死以及成熟分化障礙。損傷后的OLs不能包裹軸突形成髓鞘，進而導致PVL的發生［7，17］。

縫隙連接可以直接連接相互耦聯細胞的胞質，參與細胞間物質、能量交換和信息傳遞［12，18］。近幾年來CJIC作為新興的膜蛋白通道被廣泛關注，在脊椎動物中幾乎所有分化細胞都是通過縫隙連接來交流的，包括血紅細胞、精子、成人骨骼肌、心肌、平滑肌細胞、胃腸道上皮細胞、腦神經細胞等［19］。中樞神經系統的多種疾病（脫髓鞘疾病、癲癇、膠質瘤、腦缺血缺氧性損傷等）均證實與GJIC有關［20］。縫隙連接蛋白是由多基因家族編碼的一大類膜蛋白，在哺乳動物中發現有15種。其中Cx47表達于少突膠質細胞的髓鞘，Cx47基因突變會引起MBP的表達降低，從而導致腦白質異常損傷的脫髓鞘疾病［13，21］。

本研究結果表明，新生大鼠受到HI損傷后會出現行為、運動、發育等方面的異常表現。大腦組織病理顯示隨著損傷的加重腦組織出現細胞凋亡壞死，腦組織篩網狀及空洞形成，進而形成軟化。在透射電鏡下看到正常腦組織OLs間縫隙連接呈現連續致密的連接，細胞間通道關閉狀態，而受到HI損傷后OLs間呈間斷不連續的縫隙連接。與對照組比較，HI組腦組織中Cx47表達從術后1 d開始較對照組減少，2組間差異隨HI時間延長而更加明顯。同時免疫組化檢測發現HI組腦組織中MDP表達也較對照組減少。Cx47廣泛存在于OLs和髓鞘中，在髓鞘形成早期的發展過程中參與新髓鞘的形成［12］，HI后腦組織中Cx47表達下降與OLs及髓鞘損傷一致，甚至比髓鞘損傷出現更早，這表明在HI致新生大鼠PVL中Cx47的表達下調可能引起OLs的損傷及髓鞘化障礙，從而導致髓鞘的發育延遲。

綜上所述，HI條件下新生大鼠髓鞘發育成熟障礙，OLs間縫隙連接開放，腦組織中Cx47表達減少，提示Cx47可能對GJIC功能起到調控作用，并影響髓鞘發育。其具體作用機制有待進一步探索，并可能成為PVL治療的新靶點。