CNQX拮抗斷尾誘發小鼠前扣帶回皮質神經元c-fos基因的表達

李娜然，商麗宏，楊宇，姚陽，吳敏范

（沈陽醫學院 1.機能與形態實驗中心；2.生理學教研室，沈陽 110034）

研究［1-2］表明，截肢手術后有50%～60%以上的患者伴有幻肢痛（phantom limb pain，PLP）。前扣帶回皮質（anterior cingulate cortex，ACC）已被大量的研究［3-4］證明是痛覺的重要中樞，在疼痛感知、認知和情緒等關鍵大腦功能中發揮重要作用。PLP患者ACC的腦血容量顯著增加，與疼痛強度密切相關［5］；截肢后大鼠ACC對外周刺激與中樞刺激的反應增強［6］；神經元的c-fos基因表達［7］、NK-1受體［8］、AMPA/Kainate受體［9］與痛覺有關。目前，PLP的發病機理尚不清楚。將小鼠尾末端截斷常用于PLP產生機制的研究［4］。研究［8］表明，NK-1受體參與斷尾引起小鼠ACC神經元c-fos基因表達顯著增強的過程。但是，AMPA/Kainate受體是否參與此過程尚未見報道。因此，本研究采用免疫組化方法探討PLP的產生機理，為治療PLP提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗分組

沈陽醫學院實驗動物中心提供雌性成年昆明種小鼠36只，體質量（27±6）g［動物生產許可證編號：SCXK（遼）2010-0001］。1%戊巴比妥鈉40 mg·kg-1體質量腹腔麻醉小鼠，隨機均分為6組，每組6只：空白對照組（不做任何處理）；斷尾（尾末端2.5 cm用剪刀截斷）后0.5 h組；iv CNQX組（尾靜脈注射1%CNQX 1 mg·kg-1體質量后10 min+斷尾后0.5 h）；iv NS組（尾靜脈注射同體積生理鹽水后10 min+斷尾后0.5 h）；ith CNQX組（蛛網膜下腔注射CNQX 10 μg·10 μL-1生理鹽水后10 min+斷尾后0.5 h）；ith NS組（蛛網膜下腔注射同體積生理鹽水后10 min+斷尾后0.5 h）。

1.2 ACC c-fos基因表達的檢測

斷尾后0.5 h，將上述各組小鼠斷頭，取腦，置于4 ℃ 4%多聚甲醛中過夜固定。連續冠狀面-20 ℃冰凍切片，厚度為15 μm，用免疫組化方法常規染片及洗片等，最后使用樹膠封片。使用顯微圖像分析儀（×400放大倍數）檢測切片ACCc-fos陽性細胞的積分光密度（integrated optical density，integrated OD）和面積百分比。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 iv CNQX對斷尾誘發小鼠ACC神經元c-fos基因表達的影響

空白對照組正常小鼠ACC神經元有少量c-fos基因表達，而斷尾后0.5 h小鼠ACC神經元c-fos基因表達顯著增強，陽性細胞OD和面積百分比顯著高于空白對照組（P＜ 0.01）；iv CNQX拮抗斷尾誘發的ACC神經元c-fos基因表達顯著增強，陽性細胞OD和面積百分比與空白對照組比較無統計學差異（P＞0.05），但顯著低于斷尾后0.5 h組（P＜ 0.01），而ivNS組斷尾誘發的ACC神經元c-fos基因表達顯著增強沒有影響，陽性細胞OD和面積百分比顯著高于空白對照組及iv CNQX組（P＜ 0.01），見表1，圖1。

2.2 ith CNQX對斷尾誘發小鼠ACC神經元c-fos基因表達的影響

表1 尾靜脈或蛛網膜下腔注射CNQX對斷尾誘發小鼠ACC神經元c-fos基因表達的影響Tab.1 Effect of iv or ith CNQX on tail amputation induced c-fos gene expression in the ACC neurons in mice

圖1 iv CNQX對斷尾誘發小鼠ACC神經元c-fos基因表達的影響 ×400Fig.1 Effect of iv CNQX on tail amputation induced c-fos gene expression in the ACC neurons in mice ×400

與空白對照組正常小鼠比較，斷尾后0.5 h小鼠ACC神經元c-fos基因表達顯著增強（P＜ 0.01）；ith CNQX拮抗斷尾誘發的ACC神經元c-fos基因表達顯著增強，陽性細胞OD和面積百分比與空白對照組比較無統計學差異（P＞ 0.05），但是，顯著低于斷尾后0.5 h組（P＜ 0.01），而ith NS組對斷尾誘發的ACC神經元c-fos基因表達顯著增強沒有影響，陽性細胞OD和面積百分比顯著高于空白對照組及ith CNQX組（P＜0.01），見表1，圖2。

3 討論

圖2 Ith CNQX對斷尾誘發小鼠ACC神經元c-fos基因表達的影響 ×400Fig.2 Effect of ith CNQX on tail amputation induced c-fos gene expression in the ACC neurons in mice ×400

c-fos基因及Fos蛋白在中樞神經系統表達的部位與傷害性信號的傳導、整合分析有關［7-8］；大鼠截肢后ACC對外周刺激與中樞刺激的反應增強［6］。本研究發現，斷尾后0.5 h小鼠ACC神經元c-fos基因表達顯著增強，表明小鼠ACC的神經元能接受傷害信號的傳入，參與斷尾產生的中樞神經系統的可塑性改變。本研究結果為深入研究PLP提供了新的實驗依據。

PLP是截肢者術后常見的并發癥。目前，PLP的發病機理尚不明確。NK-1受體、AMPA/Kainate受體與痛覺有關［8-9］。NK-1受體參與斷尾引起小鼠ACC神經元c-fos基因表達顯著增強的過程［8］。但是，AMPA/Kainate受體是否參與此過程尚未見報道。本研究觀察到iv CNQX AMPA/Kainate受體拮抗劑拮抗斷尾誘發的ACC神經元c-fos基因表達顯著增強，說明外周AMPA/Kainate受體參與此過程。CNQX不易透過血腦屏障，因此本文深入研究了ith CNQX對斷尾誘發的ACC神經元c-fos基因表達顯著增強的影響。發現ith CNQX拮抗了斷尾誘發的ACC神經元c-fos基因表達的顯著增強，說明中樞AMPA/Kainate受體也參與了此過程，外周與中樞AMPA/Kainate受體可能作為鎮痛藥物治療PLP的候選靶點。