ETV4在胃腸道間質瘤中的表達及其臨床意義

徐丹，邱雪杉，2

（中國醫科大學 1.附屬第一醫院病理科，沈陽 110001；2.基礎醫學院病理學教研室，沈陽 110122）

胃腸道間質瘤（gastrointestinal stromal tumor，GIST）是胃腸道最常見的間葉源性腫瘤［1］，可發生C-KIT和血小板衍生生長因子受體α（platelet-derived growth factor receptors-α，PDGFR-α）基因突變［2］。大約10%～30%的GIST發生轉移，是具有惡性潛能的腫瘤［3］。準確判斷GIST生物學行為是治療的關鍵。迄今為止，尚沒有公認的生物學指標來判斷其生物學行為。

ETV4是多瘤促活化因子3（polyoma enhancer activator 3，PEA3）家族成員之一，在細胞的生長、侵襲以及轉移中發揮著重要的作用［4-5］。因此，本研究旨在探討ETV4轉錄因子在GIST的表達及其與臨床病理特征的關系，以及ETV4與C-KIT、PDGFR-α基因突變的關系。

1 材料與方法

1.1 標本

收集2012年至2018年2月中國醫科大學附屬第一醫院病理科確診為GIST的石蠟標本，共91例為實驗組。同時隨機選取10例實驗組的癌旁正常胃腸道組織設為對照組。納入標準：病理及免疫組化確診，免疫組化項目包含Ki67；危險度分級明確；完整的臨床病歷資料；組織蠟塊材料充足。排除標準：病理或免疫組化無法確診；危險度分級不明確；不具有完整的臨床病歷資料；組織蠟塊材料較少。

1.2 試劑及儀器

兔抗人多克隆抗體ETV4（HPA005768）購自美國Sigma公司。兔SP檢測試劑盒（KIT-9710），PBS緩沖液以及DAB顯色液均購于福州邁新生物有限公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化：采用免疫組化SP法，測定ETV4在GIST組織中的表達情況。標本石蠟塊切片4 μm厚，在75 ℃恒溫箱中放置4 h，取出后自然冷卻。將切片脫蠟、水合，放置于高壓水浴鍋內的枸櫞酸鈉緩沖液中進行熱修復，滴加內源性過氧化物酶阻斷劑，37 ℃靜置30 min后，PBS緩沖液洗片3次，一次5 min，隨后滴加山羊血清封閉液，37 ℃靜置40 min后，滴加ETV4抗體（1 ∶200）切片在4 ℃過夜。復溫、PBS緩沖液洗片后滴加生物素標記的第二抗體，37 ℃靜置30 min，PBS緩沖液洗片3次，一次5 min，隨后滴加鏈霉菌抗生素蛋白-過氧化物酶，37 ℃靜置30 min后，PBS緩沖液洗片后滴加DAB顯色液，自來水沖洗終止顯色，蘇木素復染，脫水，最后用中性樹膠封片。

1.3.2 基因檢測：用直接測序法對所有病例進行C-KIT和PDGFR-α測序，測序由廈門艾德生物有限公司完成。

1.4 GIST術后危險度評分標準

2008年4月，美國國立衛生研究院（national institutes of health，NIH）重新發布了關于原發可切除GIST的危險度評分標準。與FLETCHER等［6］提出的相比，增加了原發腫瘤的部位以及腫瘤破裂作為評判危險度的指標。見表1。

1.5 結果判定

由2名病理科醫師在400倍的光學顯微鏡下隨機觀察5個視野，每個視野至少計數100個完整腫瘤細胞。腫瘤細胞核中出現棕黃色染色為陽性，以陽性細胞比例得分乘以染色強度得分為最終評判得分。陽性細胞比例評分：＜5%為0分，5%～＜25%為1分，25%～＜50%為2分，50%～＜75%為3分，≥75%為4分。染色強度評分：未染色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。在統計學分析中，最終得分≤4分為弱陽性（+），5～8分為中等陽性（++），≥9分為強陽性（+++）。

表1 原發GIST切除后風險分級Tab.1 Proposed modification of the consensus classification for selecting patients with GISTs for adjuvant therapy

1.6 統計學分析

采用SPSS 20.0統計軟件進行統計學分析。計數資料應用行×列聯表的χ2檢驗或Fisher確切概率法；相關性分析應用Spearman相關分析。P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 GIST中ETV4的表達情況

在91例GIST組織中，有18例（19.8%）ETV4呈弱陽性表達，34例（37.4%）ETV4呈中等陽性表達，39例（42.9%）呈強陽性表達。見圖1。ETV4在癌旁正常組織中呈弱陽性表達。

2.2 ETV4在GIST中的表達與臨床病理特征的關系

圖1 ETV4在GIST中的表達 免疫組化SP法 ×400Fig.1 ETV4 expression in a gastrointestinal stromal tumor SP ×400

ETV4轉錄因子在GIST中的表達水平與患者的性別，年齡，發生部位，組織學類型無關（P＞ 0.05），而與腫瘤大小、核分裂像、Ki-67增殖指數有關（P＜0.05）。GIST最常見的轉移部位是肝臟，在本研究中共有8例發生肝臟轉移，其中6例在最初診斷時已有肝轉移，ETV4轉錄因子表達水平與肝轉移有關（P＜0.05），ETV4表達水平越高，患者發生轉移的可能也越大。見表2。此外，采用Spearman相關分析結果顯示，ETV4轉錄因子表達水平越高，其危險度越高，并且兩者具有顯著正相關（r=0.387，P＜ 0.001）。見表3。

2.3 ETV4在突變型和野生型GIST的表達的相關性

在91例GIST組織中，11例發生PDGFR-α基因突變，65例發生C-KIT基因突變，其中60例發生外顯子11突變，4例發生外顯子9突變，1例發生外顯子13突變，野生型18例，Spearman相關分析發現ETV4轉錄因子表達水平與C-KIT基因突變呈顯著正相關（r=0.324，P=0.008），差異有統計學意義。此外，ETV4轉錄因子表達水平與突變型GIST也呈顯著正相關（r=0.325，P=0.005），然而ETV4蛋白表達水平與PDGFR-α基因突變無關（P＞ 0.05）。見表3。

3 討論

GIST多見于50歲以上的老年人［1］，最常發生于胃部（60%～70%），其次為小腸（25%～36%），結直腸（5%）以及食管（5%）［7］。顯微鏡下大多數GIST由梭形細胞組成（70%），少數由上皮樣細胞（20%）或混合細胞型（10%）構成。GIST為具有惡性潛能的腫瘤，大約10%～30%的GIST發生轉移等惡性生物學行為［3］，最常見的轉移部位為肝臟（65%），其次為腹膜（21%），也可轉移至骨和肺（10%），但極為罕見［8］。因此準確判斷其生物學行為是治療GIST的關鍵。

ETS家族是最大的轉錄調控因子家族之一，其亞家族PEA3家族主要參與多種生理過程，如早期發育，器官發生和形態發生［9］。在胚胎形成時期，ETV4廣泛表達于各個組織，促進腎臟、肺、乳腺等上皮源性器官的形態發生［4］，然而ETV4很少表達于成人的正常組織中，主要表達于乳腺癌，胃癌，前列腺癌，結腸癌和卵巢癌等腫瘤組織［10］。大量研究［10-14］表明，ETV4在前列腺、乳腺癌、結直腸癌、胰腺癌、膽管癌的高度表達往往提示預后不良。在本研究中，ETV4在GIST中呈中強度陽性率為80.2%，并且與腫瘤大小，核分裂像，Ki67增殖指數，肝轉移有關。因此，ETV4的異常表達與GIST細胞的增殖，轉移等生物學行為有關。這與ZENG等［15］的研究結果一致。此外，本研究還發現ETV4轉錄因子在GIST的表達水平與腫瘤的危險度呈顯著相關，ETV4轉錄因子表達水平越高，危險度越高。因此ETV4轉錄因子可與危險度一起作為臨床判定GIST生物學行為的重要指標。

表2 GIST患者ETV4在不同病理特征中的表達Tab.2 ETV4 expression levels in the patients with different clinicopathological features of gastrointestinal stromal tumors

表3 ETV4在GIST的表達與危險度、基因突變的相關性Tab.3 Correlation of ETV4 expression in gastrointestinal stromal tumor to risk rank and gene mutation

此外，本研究還探討ETV4轉錄因子的表達與野生型，突變型GIST的關系。C-KIT以及PDGFR-α基因突變是人類患有GIST的主要原因。70%～80%的GIST有C-KIT突變，最常見的是外顯子11突變，而5%～10%GIST存在PDGFR-α突變［16］。對于既沒有C-KIT基因突變，也沒有PDGFR-α基因突變的GIST為野生型GIST［17］。在本研究中，突變型GIST中ETV4呈中強度陽性率為86.3%，并且ETV4轉錄因子的表達水平與突變型GIST顯著相關，發生C-KIT基因突變的GIST中ETV4呈中強度陽性率為86.2%，并且ETV4轉錄因子的表達水平與C-KIT基因突變具有顯著相關，然而ETV4轉錄因子的表達水平與PDGFR-α基因突變無關。因此，ETV4轉錄因子的表達水平與C-KIT基因有關。RAN等［18］研究報道PEA3家族另一成員ETS變異體1通過結合KIT增強子區域從而正調節KIT的表達水平，促進腫瘤的發生發展。大量研究［11，19-20］表明，PEA3家族具有很高的序列同源性以及相似的高度保守的DNA結合結構域，然而調節C-KIT表達的是否是這組同源序列或者DNA結合結構域目前尚不清楚，仍需要進一步的研究。

綜上所述，GIST的生物學行為除了依靠腫瘤大小，核分裂像來判斷外，ETV4轉錄因子的表達也可以作為生物學指標，以便綜合性地判斷GIST的生物學行為，更有助于指導治療。此外，ETV4轉錄因子的表達水平，還與C-KIT突變型GIST顯著相關，為GIST的治療提供新的方向和思路。