Meprin A、IL-1β與靜脈丙種球蛋白無(wú)效型川崎病的關(guān)聯(lián)性研究

陳錚潔，吳 菱，胡芳芳，應(yīng)倩倩，狄亞珍，鐘世玲

(1. 寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院，浙江 寧波 315000；2. 寧波市婦女兒童醫(yī)院 小兒風(fēng)濕免疫科, 浙江 寧波 315000；3.寧波市第一醫(yī)院 小兒風(fēng)濕免疫科，浙江 寧波 315000)

川崎病(kawasaki disease, KD)又稱(chēng)皮膚黏膜淋巴結(jié)綜合征，是主要累及中小型動(dòng)脈的全身性血管炎，已經(jīng)取代了風(fēng)濕熱成為兒童獲得性心臟病的主要病因[1]。靜脈丙種球蛋白(IVIG)是目前大家公認(rèn)的治療KD的一線(xiàn)藥物，可將動(dòng)脈瘤的風(fēng)險(xiǎn)從25%～30%，降至5%～7%[2]。據(jù)近期統(tǒng)計(jì)，IVIG-無(wú)效型KD的發(fā)生率呈上升趨勢(shì)，并呈現(xiàn)出冠狀動(dòng)脈損害(coronary artery lesions, CAL)高風(fēng)險(xiǎn)[3]。KD患兒首次IVIG- 治療效果欠佳, 是 KD 急性期治療難點(diǎn)之一。目前KD丙種球蛋白抵抗的機(jī)制尚不明確，研究表明可能與遺傳因素、炎性介質(zhì)的作用(如IL-1β、IL-6等)及T淋巴細(xì)胞活化等相關(guān)[4-5]。金屬蛋白酶Meprin A是炎癥過(guò)程中重要的蛋白水解調(diào)節(jié)劑，可將IL-1β前體形式(pro-IL-1β)轉(zhuǎn)變?yōu)橛猩锘钚缘腎L-1β，引起炎癥及組織損傷[6]。國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)在冠狀動(dòng)脈炎小鼠模型的血清中發(fā)現(xiàn)Meprin A的水平顯著升高[7]。因此, 本研究通過(guò)比較血清Meprin A、 IL-1β在KD丙種球蛋白使用前后的變化，旨在探討Meprin A、 IL-1β在IVIG-無(wú)效型KD中的臨床價(jià)值。

1 資料與方法

1.1病例選擇 2016年12月至2019年3月在我院確診的接受IVIG-標(biāo)準(zhǔn)化治療KD患兒410例為試驗(yàn)組，納入標(biāo)準(zhǔn)：診斷明確且資料完整的KD患兒，診斷標(biāo)準(zhǔn)參考AHA2017[8]。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并有其他自身免疫性疾病、感染性疾病、腫瘤等。另外選取我院同期住院的上呼吸道感染的患兒201例作為對(duì)照組，排除自身免疫性疾病、其他感染性疾病、腫瘤等。兩組患兒2周內(nèi)均未給予激素、免疫抑制劑、IVIG治療。所有試驗(yàn)組患兒均進(jìn)行IVIG及阿司匹林治療，根據(jù)IVIG治療效果(首劑IVIG-治療36 h，仍持續(xù)發(fā)熱(>38 ℃)，或給藥后熱退2～7 天甚至2周再發(fā)熱，且至少具備l項(xiàng)KD主要表現(xiàn)者，定義為IVIG-無(wú)反應(yīng))分為IVIG-有效組(355例)和IVIG-無(wú)效組(55例)。本研究患兒的家屬均簽署知情同意書(shū)及獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)【2018】倫審字(22)。

1.2檢查項(xiàng)目 記錄患兒的年齡、性別、臨床特征以及首劑應(yīng)用IVIG時(shí)間、熱程等，同時(shí)記錄實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)包括白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)，血紅蛋白(Hb)，血小板計(jì)數(shù)(PLT)，C反應(yīng)蛋白(CRP)，紅細(xì)胞沉降率(ESR)，丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)，白蛋白(ALB)，高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、NT-proBNP等。所有KD患兒入院時(shí)及隨訪(fǎng)8周內(nèi)檢測(cè)心臟彩色超聲共3～4次。根據(jù)心臟超聲提示：冠狀動(dòng)脈擴(kuò)張或冠狀動(dòng)脈瘤，定義為冠狀動(dòng)脈損害(CAL)。

血清Meprin A、IL-1β檢測(cè)：所有入組KD患兒在急性期(病程3～7 d)和緩復(fù)期(體溫正常癥狀消失，病程2～3周)分別采取空腹靜脈血4 ml，以3 000 r/min速率，離心10 min，分離出血清，保存于-80 ℃冰箱中待檢。對(duì)照組患兒入院采集空腹靜脈血2 ml，處理方法與KD組相同。取上述血清，分別使用Meprin A ELISA試劑盒及IL-1β ELISA試劑盒(分別購(gòu)于BD公司)通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)Meprin A及IL-1β水平。

1.3治療方法 對(duì)KD患兒均提供IVIG治療，IVIG-有效組及IVIG-無(wú)效組均采用同一公司生產(chǎn)的IVIG(成都蓉生藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字S19993042，50 ml：2.5 g/瓶)，同時(shí)服用阿司匹林腸溶片(辰欣藥業(yè)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H37023270，25 mg/片)：首次治療予IVIG- 2 g/(kg·次)，聯(lián)合阿司匹林30～50 mg/(kg·d)，熱退3 d后阿司匹林減量至3～5 mg/kg。IVIG-無(wú)效組：首次治療予IVIG- 2 g/(kg·次)，聯(lián)合阿司匹林30～50 mg/(kg·d)，無(wú)效再次予IVIG- 2 g/kg或激素2 mg/kg或IVIG- 2 g/kg加激素2 mg/kg，阿司匹林減量1/3～1/2，熱退3 d后阿司匹林減量至3～5 mg/kg。

2 結(jié) 果

2.1KD組與對(duì)照組臨床與實(shí)驗(yàn)室特點(diǎn) 410例KD患兒，男性226(55.1%)，中位年齡2歲，最小3月，最大10歲；對(duì)照組201例，男性108(53.7%)，中位年齡1.5歲，最小6月，最大10歲，兩組性別、年齡差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。KD患兒急性期WBC、PLT、CRP、ESR、ALT、ALB、HDL-C、NT-proBNP、Meprin A及血清IL-1β水平均顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，見(jiàn)表1。

2.2KD急性期與緩解期實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)變化 KD患兒急性期WBC、Hb、PLT、CRP、ESR、ALT、ALB、HDL-C、NT-proBNP、Meprin A及血清IL-1β水平均顯著高于緩解期(P<0.01)，見(jiàn)表2。

表1 KD組與對(duì)照組臨床特征及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較

表2 KD急性期與緩解期實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較(n=410)

2.3IVIG-有效組與無(wú)效組臨床和實(shí)驗(yàn)室特點(diǎn) 410例KD患兒中IVIG-有效組355例(86.6%)，男性193例(54.4%)，中位年齡2.4歲；IVIG-無(wú)效型型有55例(13.4%)，男性33例(60.0%)，中位年齡2.4歲，兩者之間性別、年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與IVIG-有效組比較，IVIG-無(wú)效組首劑應(yīng)用IVIG時(shí)間、熱程較長(zhǎng)，皮疹及結(jié)膜充血發(fā)生率較高，冠狀動(dòng)脈損害率更高(61.8%)(P<0.01)；IVIG-無(wú)效組血清IL-1β、Meprin A水平均顯著高于IVIG-有效組(P<0.01)； IVIG-無(wú)效組及IVIG-有效組兩組間WBC、CRP、ESR、NT-proBNP及MEP比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而Hb、PLT、ALT、ALB、HDL-C比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表3。

表3 IVIG-有效組與IVIG-無(wú)效組臨床特征及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較

2.4單因素進(jìn)行ROC分析 在6項(xiàng)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)中，血Meprin A曲線(xiàn)下面積最大(0.911)，其次是NT-proBNP(0.831)及IL-1β(0.823)，見(jiàn)圖1。有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的臨床指標(biāo)及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)對(duì)IVIG-無(wú)效型KD的診斷評(píng)價(jià)：NT-proBNP≥985.5 ng/L，預(yù)測(cè)IVIG-無(wú)效型KD的敏感性為74.5%，特異性為73.0%；Meprin A≥12.95 ng/ml，預(yù)測(cè)IVIG-無(wú)效型KD的敏感性為81.8%，特異性為89.6%；血清IL-1β≥4.05 pg/ml預(yù)測(cè)IVIG-無(wú)效型KD的敏感性為61.8%, 特異性為87.3%；當(dāng)同時(shí)滿(mǎn)足Meprin A≥12.95 ng/ml及IL-1β≥4.05 pg/ml時(shí)，預(yù)測(cè)IVIG-無(wú)效型KD的敏感性60%，特異性94.9%。見(jiàn)表4。

圖1 6項(xiàng)指標(biāo)ROC曲線(xiàn)

表4 臨床指標(biāo)(熱程、IVIG應(yīng)用時(shí)間)及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)對(duì)IVIG無(wú)效型KD的診斷效能

2.5Meprin A與其他實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的相關(guān)性分析 Spearman相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)Meprin A與IL-1β及NT-proBNP存在顯著的相關(guān)(r=0.635，P<0.01；r=0.785，P<0.01), 與WBC、CRP、ESR有一定的相關(guān)(r=0.341，P<0.01；r=0.374，P<0.01；r=0.373，P<0.01), 而與Hb、PLT、ALT、ALB、HDL-C無(wú)相關(guān)性，見(jiàn)表5。

表5 Meprin A與其他實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的相關(guān)性分析

3 討 論

KD是一種主要發(fā)生于兒童的非特異性全身血管炎性疾病，好發(fā)于5歲以下嬰幼兒，已成為兒童后天獲得性心臟病的原因之一。IVIG是KD的標(biāo)準(zhǔn)治療方法，可有效的縮短發(fā)熱時(shí)間，減少全身炎癥反應(yīng)，減少冠狀動(dòng)脈病變的發(fā)生[9]。但研究表明，有5%～38.3%的KD患者可出現(xiàn)IVIG-無(wú)反應(yīng)，且CAL作為KD 最常見(jiàn)且最嚴(yán)重的并發(fā)癥，可能與IVIG-耐藥有關(guān)[3]。本研究中IVIG無(wú)效型的發(fā)生率為13.4%，其中IVIG-無(wú)效組冠狀動(dòng)脈損害率高達(dá)61.8%。與IVIG-有效組比較，IVIG-無(wú)效組的CAL患病率增加了近5倍。IVIG-無(wú)效型KD冠狀動(dòng)脈損害的高風(fēng)險(xiǎn)，可能與IVIG-無(wú)反應(yīng)KD炎癥誘導(dǎo)更嚴(yán)重相關(guān)，但仍待進(jìn)一步研究。

IVIG-無(wú)效型KD的發(fā)病機(jī)制尚不明確。目前認(rèn)為IL-1β在KD的發(fā)病機(jī)制中起重要作用[10]，抑制IL-1β途徑以及阻斷IL-1β信號(hào)傳導(dǎo)可以抑制KD的發(fā)生發(fā)展[11]。本研究證實(shí)KD患兒急性期血清IL-1β水平明顯高于對(duì)照組及緩解期(P<0.05)，且與代表KD疾病活動(dòng)性的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)ESR、CRP、WBC正相關(guān)，或可作為評(píng)估疾病活動(dòng)性的有效指標(biāo)。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)IVIG-無(wú)效組患兒血清IL-1β水平明顯高于IVIG-有效組(P<0.05)。這提示IL-1β的水平可能決定對(duì)IVIG-的反應(yīng)[4]。本研究再進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)當(dāng)血清IL-1β≥4.05 pg/ml時(shí)預(yù)測(cè)IVIG無(wú)效型KD的敏感性及特異性均較高，因此推測(cè)IL-1β可作為IVIG無(wú)效型KD的預(yù)測(cè)指標(biāo)之一。

在體外實(shí)驗(yàn)及死亡KD患兒的尸檢中均發(fā)現(xiàn)冠狀動(dòng)脈炎中存在CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)[12-13]。同時(shí)研究還表明CD8+T淋巴細(xì)胞高度活化可能會(huì)引起IVIG的耐藥[14-15]，可見(jiàn)CD8+T細(xì)胞過(guò)度激活及其活化在IVIG-無(wú)效型KD發(fā)病及冠狀動(dòng)脈損害的機(jī)制中發(fā)揮了重要作用。有研究提示IL-1β負(fù)責(zé)抗原驅(qū)動(dòng)的CD8+ T細(xì)胞的分化，增殖，記憶以及向包括冠狀動(dòng)脈壁在內(nèi)的組織遷移[16-17]。因此，我們認(rèn)為IL-1β可能通過(guò)介導(dǎo)CD8+T淋巴細(xì)胞活化的失衡及向冠狀動(dòng)脈的遷移，參與IVIG-無(wú)效型KD的發(fā)生及其冠狀動(dòng)脈損害。

本研究還發(fā)現(xiàn)KD患兒血清Meprin A水平明顯高于對(duì)照組(P<0.01)。內(nèi)脂酶Meprins是一種含鋅金屬肽酶，包含α及β兩個(gè)亞單位，由不同的基因編碼。Meprin A是α亞基(α-α)的同二聚物或α和β亞基的異二聚體(α-β)[18-19]。Meprins具有水解內(nèi)源性生長(zhǎng)因子、血管活性肽、細(xì)胞因子和細(xì)胞外基質(zhì)的功能[6]。研究表明，Meprin A在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化及冠心病等心血管疾病患者外周血中表達(dá)增加[20]。Kentsis等[7]發(fā)現(xiàn)在KD患者急性期血清中及KD伴冠狀動(dòng)脈病變小鼠模型的冠狀動(dòng)脈組織中同樣存在Meprin A水平升高，與本研究保持一致。同時(shí)通過(guò)對(duì)比KD患兒急性期及緩解期血清Meprin A水平，我們發(fā)現(xiàn)急性期血清中Meprin A表達(dá)明顯升高，并與KD疾病活動(dòng)性相關(guān)的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)ESR、CRP、WBC呈正相關(guān)。且IVIG-無(wú)效組外周血循環(huán)中Meprin A的水平亦明顯高于IVIG-有效組(P<0.001)。當(dāng)血清Meprin A≥12.95 ng/L時(shí)預(yù)測(cè)IVIG-無(wú)效型KD的敏感性及特異性均較高，因此推測(cè)Meprin A不僅可作為KD患兒疾病活動(dòng)性的指標(biāo)之一，同時(shí)還可預(yù)測(cè)IVIG-無(wú)效型KD。

已有研究表明Meprin-A可將IL-1β前體形式(pro-IL-1β)轉(zhuǎn)變?yōu)橛猩锘钚缘腎L-1β，同時(shí)除了水解IL-6使其失活外，又可通過(guò)裂解細(xì)胞膜上的IL-6R產(chǎn)生sIL-6R介導(dǎo)IL-6反信號(hào)傳遞，促進(jìn)炎癥的發(fā)生發(fā)展[6]。IL-1β及IL-6高水平表達(dá)于在KD患兒外周血循環(huán)中，可能是KD致病及IVIG-無(wú)反應(yīng)的重要炎性細(xì)胞因子。本研究發(fā)現(xiàn)Meprin A和IL-1β之間存在顯著相關(guān)(r=0.635，P<0.01)。且當(dāng)同時(shí)滿(mǎn)足Meprin A≥12.95 ng/ml及IL-1β≥4.05 pg/m時(shí)，預(yù)測(cè)IVIG-無(wú)效型KD特異性可高達(dá)94.9%。故推測(cè)Meprin A可能通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)如IL-6途徑的失衡及IL-1β的進(jìn)一步釋放，參與IVIG-無(wú)效型KD的發(fā)生及發(fā)展。

綜上所述，Meprin A、IL-1β可能參與KD的致病過(guò)程，不僅可作為KD疾病活動(dòng)性的良好指標(biāo)，且可較好預(yù)測(cè)IVIG-無(wú)效型KD。當(dāng)然我們?nèi)孕枰M(jìn)一步擴(kuò)大樣量，建立組織細(xì)胞水平，分子水平實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步深入探討Meprin A、IL-1β在IVIG-無(wú)效型KD中的發(fā)病機(jī)制，以期能指導(dǎo)臨床。