肝臟駐留NK細胞的發育分化及其個體發生①

李佳瑞 田志剛 彭 慧 (中國科學技術大學免疫學研究所，合肥 230027)

自然殺傷(natural killer，NK)細胞是固有免疫系統的重要組成部分，其在抵御病原微生物感染和腫瘤免疫監視中發揮至關重要的作用。與T、B淋巴細胞不同，NK細胞無須預先被抗原致敏便可快速活化，通過強大細胞毒效應直接殺傷被感染的靶細胞或腫瘤細胞，可在適應性免疫應答啟動之前，保護機體免受病原體的感染[1]。NK細胞的活化是一個動態平衡過程，其功能狀態受到位于膜表面的多種活化性或抑制性受體的調控，同時也依賴多種細胞因子的調節[2,3]。NK細胞活化后，釋放大量穿孔素和顆粒酶直接殺傷靶細胞，或分泌多種細胞因子調節免疫應答，例如，NK細胞釋放大量IFN-γ和TNF-α招募淋巴細胞浸潤至感染部位并增強免疫應答，并誘導樹突狀細胞(dendritic cells，DCs)的成熟，但在慢性炎癥中也可分泌IL-10以減弱T細胞、巨噬細胞的活化[4,5]。因此，NK細胞在固有免疫和適應性免疫應答過程中都具有非常強大的功能。

NK細胞是異質性的細胞群體。近年來，我們及其他研究團隊發現表面分子CD49a和CD49b(DX5)能將肝臟NK細胞劃分為比例和數目相近的兩個亞群，其中CD49a-CD49b+NK細胞為參與外周血液循環的經典NK(conventional NK，cNK)細胞，而CD49a+CD49b-NK細胞則選擇性駐留于肝竇中，我們將其定義為肝臟駐留NK(liver-resident NK，LrNK)細胞[6,7]。隨后，科研人員在皮膚、子宮、腸道、脂肪和唾液腺等許多非淋巴組織中陸續發現了組織駐留NK(tissue-resident NK，trNK)細胞，這些新亞群的發現使我們對固有淋巴細胞(innate lymphoid cells，ILCs)家族乃至整個免疫系統有了新的認識[8-17]。

1 LrNK細胞的發現

1.1LrNK細胞的發現 肝臟是天然免疫優勢器官，與機體的新陳代謝和免疫穩態密切相關[18]。肝臟具有雙重血供，20%血供來自于肝動脈，其余均由收集消化道靜脈血液的門靜脈血液提供，門靜脈血液攜帶大量來自胃腸道的微生物及其代謝產物、食物小分子、環境毒素至肝臟。肝竇是位于肝板結構之間的蜂巢狀細小血管，動脈和靜脈血匯聚于此并通過中央靜脈流出肝臟[19]。肝竇含有豐富的淋巴細胞(如NK細胞、NKT細胞、T細胞)和大量非淋巴細胞(如肝實質細胞、肝臟星形細胞和肝竇內皮細胞等)[20]。血液在肝竇中流速緩慢，肝內免疫細胞與血液充分接觸而暴露于大量抗原之中，免疫細胞對有害病原體發生應答，對無害抗原保持耐受，從而維持肝臟穩態[21]。NK細胞在肝臟中富集，約占人肝臟總淋巴細胞的25%～40%，因此，肝臟特有NK細胞逐漸引起關注[22-24]。

早期研究發現，胚胎期小鼠肝臟有一群比例很高、表型不成熟的TRAIL+CD49b-NK細胞，其在小鼠出生后仍特異性維持于肝臟之中，提示肝臟存在不同的NK細胞亞群[25,26]。在此研究基礎之上，我們發現肝臟CD49b+NK細胞和CD49b-NK細胞基因表達譜存在顯著差異，包括活化性或抑制性受體、細胞因子、轉錄因子和毒性效應分子等，其中，CD49a在肝臟CD49b-NK細胞上選擇性表達，而在CD49b+NK細胞上幾乎不表達。轉輸實驗證明肝臟CD49a+CD49b-NK細胞表型穩定，是不同于胸腺NK細胞或cNK細胞的特殊亞群[6,7,27,28]。

LrNK細胞和cNK細胞在諸多方面存在差異。LrNK細胞具有組織特異性，呈現不成熟且高度活化的表型特征，其高表達CD49a、TRAIL、CD69，低表達NK細胞成熟相關分子如CD49b、CD11b、Ly49受體家族等[6]。cNK細胞高表達T-box家族轉錄因子T-bet和Eomes，而LrNK細胞呈T-bet+Eomes-[7]。LrNK細胞脫顆粒能力弱于cNK細胞，但其高表達殺傷相關功能分子穿孔素和粒酶B，提示其具備潛在的殺傷能力，同時分泌炎癥因子如IFN-γ、TNF-α和GM-CSF[6,7,11]。此外，LrNK細胞表達免疫記憶相關分子CXCR6和CD127(IL-7Rα)，在接觸性超敏反應和病毒感染模型中，能介導獨立于T、B淋巴細胞的半抗原特異的免疫記憶應答[6,29-34]。

1.2人LrNK細胞的發現 人NK細胞可根據細胞表面CD56的表達情況分為CD56dim和CD56bright兩個群體，其中外周血NK細胞以CD56dim為主。人肝臟組織富含CD56brightCD16-CD57-NK細胞，但僅有少量CD56brightNK細胞表達CD49a，CD56brightCD49a+NK細胞高表達T-bet而低表達Eomes，但其占肝臟總NK細胞的比例較低且在人群中波動較大[35]。CXCR6將人肝臟NK細胞劃分為比例相近的兩個亞群，CXCR6+NK細胞具有組織駐留淋巴細胞的表型特征，人外周血NK細胞則以CXCR6-為主。因此，CXCR6可能作為人和小鼠LrNK細胞的通用標志[36]。但與小鼠LrNK細胞不同的是，人肝臟CXCR6+NK細胞的細胞毒效應分子和細胞因子的分泌水平較低，并且呈現T-betlowEomeshigh，人外周血NK細胞則為T-bethighEomeslow[36]。T-bet和Eomes作為區分LrNK細胞和cNK細胞的兩個特征轉錄因子，它們在小鼠和人NK細胞亞群的表達模式上呈明顯的種屬差異[37,38]。此外，CD49e-NK細胞也被報道在人肝臟中特異性富集，該亞群可能和CXCR6+NK細胞存在重疊[39]。以上研究證實人和小鼠LrNK細胞具有不完全相同的特征。

2 LrNK的轉錄調控及發育路徑

2.1LrNK細胞的發育分化路徑 絕大部分NK細胞起源于具有自我更新及維持能力的骨髓造血干細胞(hemopoietic stem cells，HSCs)[40,41]。共同淋巴祖細胞(common lymphoid progenitors，CLPs)位于HSC下游，CLP是淋巴細胞發育早期的重要節點，受到Notch信號的調控并具有發育成T細胞、B細胞、ILCs的潛能，CLP表型定義為Lin-IL-7Rα+c-KitintSca-1intFlt3high[42-44]。CLP獲得α4β7和CXCR6的表達后，成為共同固有淋巴祖細胞(common innate lymphoid progenitors，CILPs)并失去向T、B細胞分化的潛能[45,46]。CILP產生分化潛能不同的NK祖細胞(NK progenitors，NKPs)和共同輔助樣固有淋巴祖細胞(common helper innate lymphoid progenitors，CHILPs)。NKP分化為cNK細胞，而CHILP最終分化為包括LrNK細胞在內的ILC1、ILC2、ILC3以及淋巴組織誘導(lymphoid tissue inducer，LTi)細胞，因此，LrNK細胞和cNK細胞發育路徑不同[46-49]。

CD122(IL-2Rβ)作為IL-15受體復合物的組成部分，使NKP接受IL-15信號得以存活和增殖，因而CD122被視作NKP的標志分子。早期研究將NKP表型定義為Lin-CD122+NK1.1-CD49b-[50]，但其與OP9-DL1基質細胞體外共培養后也能產生T細胞，說明此NKP具有分化為NK細胞和T細胞的雙向潛能[51]。隨后，NKP進一步被劃分為Lin-CD27+CD122-IL-7Rα+Flt3-CD244+的pre-NKP(pre-NK progenitors)和Lin-CD27+CD122+IL-7Rα+Flt3-CD244+的rNKP(refined-NK progenitors)，它們都僅向NK細胞定向分化[48,52]。由于上述關于NKP表型鑒定的研究是在trNK細胞和其他ILCs被發現之前開展的，pre-NKP和rNKP是否具有向trNK細胞和其他ILCs分化的潛能尚需進一步研究。NKP的下游分化過程伴隨著表型變化，產生不成熟NK (immature NK，iNK)細胞和成熟NK(mature NK，mNK)細胞。NK1.1和NKG2A/CD94最早獲得表達，NKp46、Ly49受體、CD49b、CD11b、CD43、KLRG1等逐漸獲得表達，同時下調CD51、CD27、CXCR3[47,53]。CD49b可表征NK細胞的成熟狀態，iNK細胞表型定義為Lin-CD49b-NK1.1+CD122+，mNK細胞表型定義為Lin-CD49b+NK1.1+CD122+[26]。此外，CD27和CD11b也能劃分不同成熟階段的NK細胞[54]。

2.2參與調控LrNK細胞發育分化的轉錄因子 LrNK細胞和cNK細胞的發育過程受到不同組合轉錄因子的調控(圖1)[55]。NK細胞高表達Nfil3(E4bp4)，其作用于IL-15信號下游，與NK細胞發育分化密切相關[56,57]。Nfil3在NK細胞發育早期發揮關鍵作用，調控Eomes、Id2多種轉錄因子的表達[58-60]。特異性敲除NKp46+NK細胞的Nfil3并不影響NK細胞的存活與功能，說明NK細胞的晚期成熟不完全依賴Nfil3[61]。Nfil3缺陷導致cNK細胞幾乎缺失，而包括LrNK細胞在內的特定組織trNK細胞所受影響較小，說明cNK細胞更加依賴Nfil3[7,11]。此外，轉錄因子Tox、Ets1、Tcf-1對NK細胞發育早期階段也很重要[43,44,62,63]。

圖1 小鼠ILC的發育路徑Fig.1 Development of innate lymphoid cells(ILCs)in miceNote: HSCs differentiate into a a series of developmental intermediates，which finally give rise to different ILC subsets.Downstream of HSCs，CLPs further differentiate into CILPs that can generate NKPs and CHILPs under the regulation of different transcriptional factors.NKPs exclusively produce cNK cells，while CHILPs differentiate into LTi cells via the LTi progenitor(LTiP)stage，or differentiate into ILCPs that possess ILC1，ILC2 and ILC3 potential.Nfil3(nuclear factor IL-3 induced),Id2(inhibitor of DNA binding 2),Tox(thymocyte selection-associated high mobility group box protein),Tcf-1(T cell factor 1),Ets1(avian erythroblastosis virus E26 homolog-1),Gata3(GATA binding protein 3),PLZF(promyelocytic leukemia zinc finger),T-bet(T-box transcription factor),Eomes(Eomesodermin),Rorα(RAR-related orphan receptor α),Rorγt(RAR-related orphan receptor γt),Ahr(Aryl hydrocarbon receptor)

ILCs各亞群的發育都受到Id2的調控作用，其參與調控CILP、CHILP、NKP的產生[64,65]。表達Id2、Gata3的CHILP具有發育成為LrNK細胞和其他ILCs以及LTi細胞的潛能，但不能發育成為cNK細胞[65,66]。PLZF是Id2的潛在靶基因，PD-1+PLZF+CHILP進一步分化產生ILCs，LrNK細胞和黏膜ILC1s依賴T-bet的調控并分泌Th1型細胞因子IFN-γ，由于它們的發育路徑十分相近，因此LrNK細胞也被稱為肝臟ILC1s[11,67,68]。

T-bet和Eomes對NK細胞發育晚期階段十分關鍵，它們對NKP向成熟NK細胞分化是必需的，若二者同時缺失則無法產生正常的NK細胞，NKP數量不受影響而iNK和mNK細胞顯著減少。LrNK細胞嚴格依賴T-bet而非Eomes，T-bet缺陷導致LrNK細胞大幅減少[38,69]。此外，Hobit和Blimp1參與調控具有組織駐留特性的淋巴細胞的發育，Hobit缺陷導致LrNK細胞顯著減少而對cNK細胞幾乎無影響[70-72]。

3 影響LrNK細胞的微環境因素

微環境的外源性因子能誘導NK細胞表型或功能發生改變，如直接影響NK細胞的活化、效應分子的表達及細胞毒效應。IL-2和IL-15在NK細胞發育、增殖和活化中發揮重要作用[73]。IL-12和IL-18促進NK細胞表達IFN-γ和TNF-α，NK細胞在IL-12/15/18協同刺激可迅速活化并發揮強大的細胞毒效應，在二次刺激時相對初次接受刺激的NK細胞具有更強大的功能效應。因此，使用IL-12/15/18協同刺激預先活化NK細胞也被視作癌癥治療的新思路[74]。此外，LrNK細胞與cNK細胞都依賴IL-15而非IL-7，IL-7缺陷使ILC2、ILC3大量減少但ILC1和cNK細胞基本不受影響，IL-15缺陷則導致相反結果，因此，對IL-15的依賴性是區分group 1 ILCs與其他ILCs的重要依據之一[38,46]。

已有研究證實，NK細胞在腫瘤微環境中具有可塑性，CD49a-CD49b+Eomes+cNK細胞在TGF-β信號誘導下轉變為中間階段CD49a+CD49b+Eomes+ILC1(intILC1)和CD49a+CD49b-Eomesint ILC1，其上調表達抑制性受體CTLA-4、LAG3及NKG2A和促血管生成相關基因PSGF-AB，并且分泌大量TNF-α和GM-CSF，cNK細胞的數量和功能都顯著下降，最終導致腫瘤逃脫固有免疫系統的監視。但腫瘤ILC1胞內TGF-β受體下游經典信號通路的活性并未增強，可能是非經典的TGF-β信號誘導NK細胞轉變，如SMAD4表達被抑制所導致的非經典的TGF-β信號誘導NK細胞向ILC1轉化[75-77]。與依賴TGF-β信號的腫瘤ILC1類似，TGF-β對于維持唾液腺中CD49a+ILC1的表型及存活十分重要[15]。另外，TGF-β影響NK細胞內DAP12和 mTOR的活性，使NK細胞抗腫瘤能力下降[78-80]。以上研究提示TGF-β在NK細胞的可塑性和功能方面具有重要影響。

IFN-γ既是NK細胞的重要效應分子，也能影響其發育和功能，IFN-γ缺陷小鼠肝臟的NK細胞顯著減少，且無法正常應答PolyI:C的刺激[81]。而脾臟等其他臟器NK細胞數量不受影響，提示IFN-γ信號可能主要影響LrNK細胞而非cNK細胞。Ahr在小鼠LrNK細胞和人組織駐留的CD56brightNK細胞內組成性高表達，Ahr-/-小鼠的LrNK細胞比例和數量顯著下降，Ahr缺陷使LrNK細胞快速擴增、耗竭并凋亡，說明LrNK細胞內源性依賴Ahr，該依賴性可能與肝臟雙重血供及其微環境相關[82,83]。穩態下的Ahr與分子伴侶結合形成復合物游離胞漿之中，當其結合細胞內源性或外源性配體后轉移至細胞核中調控基因轉錄。Ahr外源性配體多是來自環境中的食物小分子和微生物代謝物，如黃豆來源的異黃酮、十字花科蔬菜來源的異硫氰酸鹽、弓形蟲催化產生的脂氧素A4或由莽草酸途徑合成的芳香族化合物等[84,85]。因此，肝臟門靜脈血液中含有大量Ahr的潛在配體，LrNK細胞內Ahr易被活化，但目前尚不清楚該配體的具體來源和組成。

4 LrNK細胞的個體發生

骨髓造血干細胞是成年個體造血的主要來源，而胚胎發育期間主要依靠卵黃囊(yolk sac，YS)、主動脈-性腺-中腎(aorta-gonad-mesonephros，AGM)區域和胎肝(fetal Liver，FL)發揮造血功能，直至個體出生后才逐漸被骨髓代替為主要的造血器官[86,87](圖2)。卵黃囊較早發揮造血功能，E7.0(embryo，7.0)天在小鼠胚胎卵黃囊最早出現造血祖細胞，包括原始紅系祖細胞和巨核巨噬前體細胞[88,89]。E8.25天卵黃囊出現紅系髓系祖細胞(erythromyel-oid progenitors，EMPs)和淋巴系髓系祖細胞(lympho-myeloid progenitors，LMPs)，同時胚胎心臟開始跳動，卵黃囊周圍發生血管重塑使造血祖細胞進入血液循環并在E9.5天到達胎肝[90,91]。另外，E8.5天在主動脈旁胚臟壁(Para-aortic splanchnopleure，P-Sp)和AGM區域最早出現HSC及其前體，于 E10.5天到達胎肝并進一步分化為pre-HSC(pre-hematopoietic stem cells，pre-HSCs)和mHSC(mature hematopoietic stem cells，mHSCs)[92]。因此，卵黃囊造血系統對于胚胎早期生長至關重要[93]。胎肝于E11.5天開始成為主要的造血部位，多種造血祖細胞快速分化成熟并大量擴增，而脾臟和骨髓則分別在E13天和E15天發育成為造血器官，骨髓成為個體出生后的主要造血器官，但肝臟、脾臟仍保留一定造血潛能[94]。

圖2 小鼠NK細胞的個體發生Fig.2 Ontogeny of NK cells in miceNote: Embryonic yolk sac(YS)is the initial site of hematopoiesis during ontogeny.Hematopoietic progenitors(HP)and erythromyeloid pro-genitors (EMP) first appear in the YS and migrate to fetal liver(FL).Then，HSC precursors from AGM migrate to the FL，which becomes the major site of hematopoiesis during fetal life.Mature NK cells(mNK)gradually emerge in the FL，spleen，peripheral blood and thymus at different time points.

目前認為NK細胞都起源于造血干細胞，然而骨髓移植小鼠LrNK細胞的比例和數量低于正常小鼠，提示骨髓僅具有部分產生LrNK細胞的能力。將骨髓細胞和肝臟單個核細胞分別轉輸后都能維持受者鼠的存活，說明肝臟單個核細胞中包含造血祖細胞。骨髓嵌合實驗也證明肝臟可能具有LrNK細胞的直接前體細胞，而骨髓造血干細胞傾向分化為cNK細胞，以上發現提示LrNK細胞可能來源于胚胎時期便存在于肝臟中且能自我更新的造血祖細胞，肝臟微環境支持其存活[6]。近年來發現組織駐留的巨噬細胞和肥大細胞起源于卵黃囊的EMP[95,96]。LrNK細胞是否也可能來自EMP而獨立于骨髓造血系統之外？還需進行深入研究。

NK細胞在胎肝中的發育早于骨髓和外周。胎肝于E13.5天開始出現NKP(Lin-CD122+NK1.1+CD49b-)，而E14.5天外周血最早出現NKP并在E18.5天才逐漸增多。胎肝中的iNK細胞和mNK細胞分別在E14.5天和E15.5天出現，并在E16.5天出現具有殺傷功能的NK細胞，這一發育過程早于外周，說明最早在胎肝出現NK譜系并通過血液循環遷往其他部位[51]。

5 總結與展望

近十年來，關于NK細胞的區域免疫學特性研究越來越多。小鼠CD49a+CD49b-LrNK細胞的發現為固有免疫研究打開新的篇章，非淋巴組織特有的ILCs逐漸受到關注[6,7,97]。LrNK細胞具有潛在的殺傷能力，并且分泌大量IFN-γ、TNF-α和GM-CSF等炎癥細胞因子調節免疫應答[11]。人肝臟中也存在與外周血NK細胞顯著不同的NK細胞亞群，但人LrNK細胞的表型界定仍存在爭議[35]。本文討論了起源于HSC的多種固有淋巴細胞的發育過程，包括cNK細胞、LrNK細胞和其他ILCs[40]。LrNK細胞與cNK細胞在發育分化和轉錄調控上存在顯著差異，它們具有不同的發育路徑并受不同組合轉錄因子的調控，其上游祖細胞分別是 CHILP和NKP，LrNK細胞依賴PLZF、Hobit、T-bet，而cNK細胞需要Nfil3、Ets1、Eomes[38,69]。微環境因素也對NK細胞產生影響，如TGF-β誘導cNK細胞向ILC1轉化。LrNK細胞和cNK細胞的個體發生過程存在差異，胚胎和新生小鼠肝臟NK細胞絕大部分為LrNK細胞，個體出生后cNK細胞才逐漸增多[26]。

在NK細胞發育分化過程中，pre-NKP和rNKP部分表達PLZF，提示NKP與ILCP分化路徑之間可能存在某一階段的重疊[98]，NKP是否也能分化為LrNK細胞？組織微環境與NK細胞的發育和塑造密切相關，目前還不清楚在肝臟微環境中對LrNK細胞發育分化中起關鍵作用的因素[24,76,81,82]。此外，LrNK細胞和cNK細胞的起源仍存在疑問，盡管已經證實成年小鼠肝臟中存在自我維持并更新的造血祖細胞，其可能直接分化成為LrNK細胞，但我們對其知之甚少[6]。胚胎期卵黃囊造血系統支持胚胎的存活并發揮早期造血功能，皮膚、肺臟和肝臟駐留的巨噬細胞以及脂肪組織、胸膜腔內駐留的肥大細胞都起源于卵黃囊的EMP，那么同樣具有駐留特性的LrNK細胞是否也可能起源于胚胎發育早期的造血祖細胞而獨立于骨髓造血系統之外？關于LrNK細胞的起源需進一步深入探究。