SMAC類似物Birinapant對大鼠肝臟缺血再灌注損傷的保護作用及機制研究①

高 宏 易竹君 李培志 朱稀雯 龔建平 陳 翔

(重慶市第四人民醫院肝膽外科，重慶 400014)

第二線粒體衍生的半胱天冬酶激活劑(second mitochondria derived activator of caspases,SMAC)是一種存在于線粒體內調節細胞凋亡的蛋白質，目前關于SMAC及SMAC類似物的研究主要集中在其促進腫瘤細胞凋亡的研究上[1-4]。Birinapant作為一種典型的SMAC類似物，能夠通過與cIAP1結合誘導cIAP1的降解進而促進細胞的凋亡[5,6]。許多cIAPs抑制劑被設計為與SMAC類似物有相同的作用，用于癌癥的治療[7-9]。然而，關于SMAC類似物在炎癥反應中的研究還很少。

肝臟缺血/再灌注損傷(ischemia/reperfusion injury,I/RI)是實驗以及臨床肝移植術成功與否的重要因素。I/RI分為缺血期損傷和再灌注期損傷，就再灌注期損傷而言，內毒素(lipopolysaccharide,LPS)誘導的庫普弗細胞(kupffer cells,KCs)過度激活是再灌注期I/RI的重要誘因之一。其機制與再灌注期LPS激活KCs絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號通路有關[10,11]。而巨噬細胞內LPS介導的MAPK信號通路的激活又與腫瘤壞死因子受體相關因子3(tumor necrosis receptor related factor 3,TRAF3)的聚泛素化有關[12,13]。TRAF3 K48連接的TRAF3聚泛素化導致髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)復合物的蛋白降解和胞質轉位，通過促進p-JNK和p-p38的表達激活MAPKs信號通路，誘導炎癥因子表達，如TNF-α、IL-1、IL-6以及IL-1β等[12,14]。

研究已經證實SMAC類似物Birinapant可通過抑制cIAP1的表達抑制TRAF3的降解以及抑制LPS誘導的RAW264.7細胞內MAPK信號通路激活，進而減輕LPS介導的炎癥反應[15]。那么，Birinapant預處理對大鼠肝臟缺血再灌注損傷的保護作用是否通過抑制KCs中TRAF3的降解來抑制再灌注期LPS介導的KCs MAPK信號通路激活，從而抑制炎癥因子釋放，進而抑制肝臟I/RI，目前尚無相關研究。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑 TRAF3、cIAP1、p38、p-p38、JNK、p-JNK以及β-actin的主要抗體購自Abcam(Cambridge，MA,USA)。用于檢測TNF-α、IL-6和IL-1β的酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz,CA,USA)。Birinapant購自Selleckchem(Burlington,ON,Canada)。

1.1.2動物和分組 由重慶醫科大學實驗動物中心提供的SD雄性大鼠，年齡5周，重(150±17.4)g。所有實驗動物都嚴格遵循國家動物研究和法律規定，均受到了人性化的護理。將大鼠分為空白對照組(Blank)、對照組(Control)和Birinapant預處理組(Birinapant)。Blank組不做任何處理，Control組腹腔注射30 mg/kg體重的生理鹽水，1 h后構建大鼠肝臟I/RI模型，Birinapant組腹腔注射30 mg/kg體重的Birinapant，1 h后構建大鼠肝臟I/RI模型。各組在模型建立4 h后取下肝臟組織、采集血液樣本、提取肝臟KCs，將KCs按4×105個/孔的細胞密度接種在6孔板中用完全培養基培養。

1.2方法

1.2.1組織病理學研究 肝組織固定在10%福爾馬林中，切成5 μm厚的切片。將石蠟切片進行HE染色，具體方法詳見參考文獻[6]。

1.2.2免疫印跡 KCs中TRAF3和cIAP1、p-JNK、 p-p38等蛋白表達通過Western blot檢測。即提取KCs細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，所得蛋白樣品與上樣緩沖液以4∶1混合后變性，取50 μg/孔蛋白樣品上樣，依次進行電泳、轉膜，5%的BSA在37℃封閉1 h，分別加入不同抗體4℃過夜孵育，TBST洗3遍×15 min，加入對應的二抗(1∶5 000)37℃孵育1 h，TBST 洗3 遍×15 min，ECL化學發光顯影。

1.2.3KCs免疫熒光實驗 將KCs以1×104個/孔的密度接種在含有撥片的24孔板中培養24 h，通過固定、透膜、封閉，加入適量適宜濃度的cIAP1和TRAF3 抗體4℃過夜孵育，用PBS洗3次×1 min/次，加入相應的熒光二抗在室溫下避光孵育1 h，用PBS 洗3 次×1 min/次，加入適量DAPI 處理3～5 min，固定、封片，正置顯微鏡觀察、采圖。

1.2.4酶聯免疫吸附試驗(ELISA) ELISA檢測小鼠血漿中TNF-α、IL-6和IL-1β的水平。

2 結果

2.1Birinapant預處理抑制肝臟I/RI時肝組織的損傷和炎癥反應 HE染色下觀察Blank組、Control組和Birinapant組，如圖1所示，與Blank組相比，Control組在肝臟I/RI建立后4 h肝小葉結構明顯紊亂、大量肝細胞空泡樣變性、有明顯的肝細胞壞死和大量炎癥細胞浸潤等，即有明顯的肝組織損傷和炎癥反應。與Control相比，Birinapant組肝小葉結構基本正常，僅見少量肝細胞氣球樣變性和少量炎癥細胞浸潤。可見，Birinapant預處理可顯著抑制肝臟I/RI時肝臟損傷和炎癥反應。

2.2Birinapant預處理降低肝臟I/RI時血清TNF-α、IL-6及IL-1β的表達 檢測各組血清中炎癥相關因子TNF-α、IL-6及IL-1β的水平。結果如圖2所示，肝臟I/RI模型可以促進炎癥因子TNF-α、IL-6及IL-1β的分泌，而預處理Birinapant可以顯著抑制這些炎癥因子的表達，差異均具有統計學意義(P<0.05)。

圖1 大鼠肝臟組織HE染色Fig.1 HE staining of rat liver tissue

圖2 大鼠血清中TNF-α、IL-6及IL-1β的表達水平Fig.2 Expression levels of TNF-α,IL-6 and IL-1β in rat serumNote: *.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001.

2.3Birinapant預處理對I/RI肝臟KCs中cIAP1/TRAF3/MAPK信號通路的影響 如圖3所示：肝臟I/RI可明顯促進KCs中cIAP1的表達，抑制TRAF3的表達，而預處理Birinapant可抑制cIAP1的表達，促進TRAF3的表達。

KCs的Western blot結果如圖4所示：肝臟I/RI可以明顯促進KCs中cIAP1的蛋白表達進而誘導TRAF3的降解，并通過促進p-JNK和p-p38的表達激活MAPK信號通路。預處理Birinapant可顯著抑制KCs內cIAP1的表達進而抑制TRAF3的降解，并通過抑制p-JNK和p-p38的表達抑制MAPK信號通路的激活。Birinapant預處理對大鼠肝臟I/RI的保護作用可能與Birinapant抑制cIAP1/TRAF3/MAPK信號通路的激活相關。

3 討論

研究表明肝臟I/RI主要與缺血期產生的LPS在再灌注期時通過過度活化肝臟KCs，激活KCs中MAPK炎癥信號通路，誘導炎癥因子表達有關[6,7]。而SMAC類似物Birinapant可通過抑制TRAF3的降解以及抑制LPS誘導的RAW264.7細胞內MAPK信號通路激活，進而抑制LPS介導的炎癥反應[10]。為了進一步探索以上假設，提取三組大鼠的KCs做以上實驗。

圖3 免疫熒光檢測KCs中cIAP1和TRAF3的表達Fig.3 Immunofluorescence detected expression of cIAP1 and TRAF3 in KCs

圖4 Western blot檢測KCs中cIAP1和TRAF3以及與MAPK信號通路密切相關的JNK、p-JNK、p38及p-p38的蛋白表達Fig.4 Western blot detected protein expressions of cIAP1 and TRAF3 in KCs and JNK,p-JNK,p38 and p-p38 which closely related to MAPK signal pathwayNote: *.P<0.05,**.P<0.01.

肝臟I/RI是導致肝移植術后肝功能不良或進而導致肝移植失敗的重要原因，目前仍無有效的治療策略。就再灌注期損傷而言，研究已證實LPS誘導的單核/巨噬細胞過度激活是再灌注期I/RI的重要誘因之一[16,17]。由于機體80%～90%的單核/巨噬細胞為滯留于肝血竇內的KCs，因此，如何避免再灌注期KCs的過度激活已成為肝移植外科必須面對的挑戰之一[18]。

SMAC是一種存在于線粒體內起調節細胞凋亡的蛋白質。目前發現SMAC可能具有促進腫瘤細胞凋亡的作用，如SMAC可促進胃癌、卵巢癌以及非霍奇金淋巴瘤等腫瘤細胞的凋亡[3,4,19]。其機制可能與在一些因素的刺激下，SMAC可從線粒體釋放到細胞質與胞質中的cIAPs結合，抑制cIAPs抗凋亡活性，促進細胞凋亡，進而在一定程度上可抑制腫瘤的生長。隨著近年來對SMAC蛋白結構和功能的深入了解，將SMAC類似物應用到各種腫瘤中的治療成為了研究的新熱點。Birinapant作為一種典型的SMAC類似物，能夠通過cIAP1結合誘導cIAP1的降解進而促進細胞的凋亡[5]。許多cIAPs抑制劑被設計為與SMAC類似物有相同的作用，用于癌癥的治療[7]。然而，關于SMAC類似物在炎癥反應中的研究還很少。

LPS是革蘭氏陰性桿菌外膜的主要組成部分，能誘導巨噬細胞炎癥因子分泌，其主要的分子機制與LPS激活單核/巨噬細胞MAPK信號通路，促進炎癥因子釋放有關[20]。而巨噬細胞內LPS介導的MAPK信號通路的激活又與TRAF3的聚泛素化有關[12]。研究表明TRAF3 K48連接的TRAF3聚泛素化導致MyD88復合物的蛋白降解和胞質轉位，通過促進p-JNK和p-p38的表達激活MAPKs信號通路，誘導炎癥基因表達[14]。而研究已經證實SMAC類似物Birinapant可通過抑制cIAP1的表達抑制TRAF3的降解以及抑制LPS誘導的RAW264.7細胞內MAPK信號通路激活，進而減輕LPS介導的炎癥反應[15]。然而，Birinapant預處理對大鼠肝臟缺血再灌注損傷的保護作用是否通過抑制KCs中TRAF3的降解來抑制再灌注期LPS誘導的KCs內MAPK信號通路激活，從而抑制炎癥反應和炎癥因子的釋放，進而抑制肝臟I/RI，目前尚無相關研究。

在本研究中，預實驗發現Birinapant預處理可以減輕肝臟I/RI，但具體機制仍不清楚。通過Birinapant預處理以及建立大鼠肝臟I/RI模型等，發現與Control組相比，Birinapant預處理可以顯著抑制肝臟I/RI誘導的肝組織損傷和炎癥反應、降低血清中TNF-α、IL-6及IL-1β炎癥因子水平、抑制KCs中cIAP1的表達進而抑制TRAF3的降解以及可抑制KCs中p-JNK和p-p38的表達進而抑制MAPK信號通路的激活。本研究得出的結論是預處理Birinapant可以通過抑制cIAP1的表達抑制TRAF3的降解，進而通過抑制MAPK信號通路的激活，達到對肝臟I/RI的保護作用。

研究成果為進一步探討肝移植I/RI的分子機制以及SMAC類似物在炎癥方面的作用奠定了實驗基礎，具有一定的理論意義。研究也存在一定不足，如沒有直接用肝移植模型進行研究，也未深入探討其他可能存在的分子機制。