UVRAG調控金黃色葡萄球菌誘導的細胞自噬及其細菌的胞內存活①

楊 彬 王郅杰 么宏強 鄧天健 額爾敦木圖 (內蒙古農業大學獸醫學院，呼和浩特 010018)

自噬可以保護細胞免受細胞內病原體的侵襲，但是自噬也可以被病原體利用以利于其存活[3]。細胞內感染SA后，SA能夠破壞自噬體并逃逸到宿主細胞的細胞質，并且抑制吞噬體與溶酶體的融合，此外，藥物誘導的自噬促進細胞內SA的復制[4，5]。

研究發現紫外線抵抗相關基因(UV radiation resistance-associated gene,UVRAG)能夠與Beclin1等形成復合體從而促進自噬[6]。A群鏈球菌在內化、入侵宿主細胞過程中能夠通過某些分子(如NOD樣受體NLRX1)與Beclin1-UVRAG復合體相互作用，從而影響A群鏈球菌誘導的自噬及其侵入[7]。研究發現Bcl-xL通過與Beclin1-UVRAG相互作用抑制A群鏈球菌的內化[8]。近期研究發現UVRAG被SMAD特異性E3泛素蛋白連接酶1(SMAD specific E3 ubiquitin protein ligase 1,SMURF1)泛素化能夠增強自噬的成熟[9]。國內研究人員發現UVRAG與白血病的惡性進展有關[10]。同時有研究顯示UVRAG參與了肝臟的脂肪變性[11]。可見，UVRAG的研究已成為一個熱點課題。然而，UVRAG能否調控SA誘導的自噬及其在胞內的存活目前尚未見報道。因此，本研究通過SA刺激HeLa細胞建立體外感染模型，從細胞水平探討UVRAG對SA誘導HeLa細胞自噬及胞內菌存活的影響。

1 材料與方法

1.1材料 HeLa細胞由黑龍江八一農墾大學生命科學技術學院張華教授惠贈；金黃色葡萄球菌ATCC29213由黑龍江八一農墾大學生命科學技術學院陳志寶教授惠贈；pCI-neo質粒由黑龍江八一農墾大學動物科技學院周玉龍副教授惠贈；pCI-neo-HA-hUVRAG質粒、EGFP-LC3質粒購自Addgene公司；LipofectamineTM3000轉染試劑購自Invitrogen公司；人UVRAG小干擾RNA由上海吉瑪公司合成；兔多克隆抗體LC3B購自Novus公司；小鼠單克隆抗體p62、兔多克隆抗體UVRAG、小鼠單克隆抗體GAPDH均購自Abcam公司；兔抗金黃色葡萄球菌多克隆抗體購自北京博奧森生物技術公司；辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標記的兔抗小鼠IgG、HRP標記的山羊抗兔IgG購自北京中杉金橋生物公司； RBITC標記的山羊抗兔IgG購自北京索萊寶生物公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養 將HeLa細胞加入含有10%胎牛血清的DMEM，置于37℃ 0.5%CO2的細胞培養箱中培養。

1.2.2UVRAG的RNA干擾及過表達 將HeLa細胞在轉染前一天接種于細胞培養板中，按照LipofectamineTM3000轉染試劑說明書進行轉染，干擾UVRAG試驗分為對照組和UVRAG siRNA干擾組；過表達UVRAG試驗分為對照組(轉染pCI-neo質粒)和過表達UVRAG組(轉染pCI-neo-HA-hUVRAG質粒)。

1.2.3SA感染細胞 將SA(MOI=100)分別與HeLa細胞共培養1.5 h后，加入含有慶大霉素(100 μg/ml)的細胞培養液共培養30 min殺死胞外菌，更換培養液繼續分別培養HeLa細胞1、2、3、4、5 h，收集細胞后Western blot法檢測LC3B、p62及UVRAG的表達水平。

用上述同樣的感染方法將SA(MOI=100)分別感染干擾及過表達UVRAG的HeLa細胞1、2、3、4、5 h，收集細胞后Western blot法檢測LC3B、p62及UVRAG的表達水平。

1.2.4Western blot法檢測LC3B、p62及UVRAG的蛋白表達水平 裂解液RIPA裂解并提取各組細胞蛋白，BCA法測定提取的蛋白濃度，將蛋白煮沸變性后進行SDS-PAGE分離，電泳后將蛋白進行轉膜，分別用1∶1 000稀釋的LC3B、p62、UVRAG及GAPDH抗體進行過夜孵育，用1∶5 000稀釋的HRP標記的二抗孵育1 h，漂洗后進行ECL顯色，凝膠成像系統顯影后用Quantity One軟件進行灰度分析。

原譯：During the Yongzheng reign,the nine-peaches design was commonly seen on the famille-rose ware such as globular vases,olive-shaped vases and plates are decorated with branches that extend from the outside into the bowl.

1.2.5激光共聚焦顯微鏡觀察 將EGFP-LC3質粒及pCI-neo-HA-hUVRAG質粒用LipofectamineTM3000轉染試劑共轉染HeLa細胞，對照組將EGFP-LC3質粒及pCI-neo質粒共轉染HeLa細胞，轉染24 h后用SA感染，3 h后多聚甲醛固定細胞，用TritonX-100穿孔后封閉，加入1∶100稀釋的抗SA抗體孵育2 h，漂洗后加入1∶100稀釋的RBITC標記的山羊抗兔IgG孵育1 h，激光共聚焦顯微鏡觀察EGFP-LC3的點狀聚集。

1.2.6平板計數法計算胞內SA數量 分別轉染siRNA UVRAG和pCI-neo-HA-hUVRAG，24 h后分別用SA感染1、2、3、4、5 h，用含有0.5%的TritonX-100裂解細胞，將裂解液進行梯度倍比稀釋，涂于胰蛋白胨大豆瓊脂培養基平板上進行活菌平板計數。

1.3統計學處理 運用SPSS17.0統計軟件分析進行方差分析，P<0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1SA感染HeLa細胞誘導發生自噬 SA感染HeLa細胞1、2、3、4、5 h LC3 Ⅱ 的表達量與0 h的表達量相比顯著升高(P<0.05)，其中感染1 h和2 h的LC3 Ⅱ 的表達量達到最高，感染1 h和2 h的p62的表達量與0 h相比顯著降低(P<0.01)，SA感染HeLa細胞3 h、4 h和5 h的LC3 Ⅱ 的表達量與1 h和2 h的表達量相比顯著降低(P<0.05)，感染3 h、4 h和5 h 的p62的表達量與1 h和2 h的表達量相比顯著升高(P<0.05)。感染1、2、3、4、5 h的UVRAG表達量與0 h相比顯著升高(P<0.05)(圖1)。

2.2干擾或過表達UVRAG調控SA誘導的自噬 與對照組相比，感染1、2、3、4、5 h干擾UVRAG組LC3Ⅱ的表達量顯著降低(P<0.05)，p62的表達量顯著升高(P<0.05)(圖2)。

感染1、2、3、4、5 h過表達UVRAG組與對照組相比，LC3Ⅱ的表達量顯著升高(P<0.05)，p62的表達量顯著降低(P<0.05)(圖3)。

將SA(MOI=100)感染過表達UVRAG的HeLa細胞3 h，免疫熒光后用激光共聚焦顯微鏡觀察EGFP-LC3的點狀聚集。結果顯示，過表達UVRAG組與對照組相比，EGFP-LC3的點狀聚集數量顯著升高(P<0.05)(圖4)。

圖1 SA感染HeLa細胞誘導自噬相關蛋白表達Fig.1 Autophagy was induced in HeLa cells infected with SANote: A.Protein expression level of LC3B,p62 and UVRAG in Western blot;B.Semiquantitative analysis of protein bands of LC3B,p62 and UVRAG.*.P<0.05 vs 0 h，#.P<0.01 vs 0 h，△.P<0.05 vs 1 h and 2 h，▲.P<0.05 vs 1 h and 2 h.

圖2 抑制UVRAG降低SA感染HeLa細胞誘導的自噬水平Fig.2 Autophagy was suppressed in SA infected HeLa cells by siRNA knockdown of UVRAGNote: A.Protein expression level of LC3B,p62 and UVRAG in Western blot;B.Semiquantitative analysis of protein bands of LC3B and p62.*.P<0.05 vs NC.

圖3 過表達UVRAG升高SA感染HeLa細胞誘導的自噬水平Fig.3 Autophagy was elevated in SA infected HeLa cells by over-expression of UVRAGNote: A.Protein expression level of LC3B,p62 and UVRAG in Western blot;B.Semiquantitative analysis of protein bands of LC3B,p62 and UVRAG.*.P<0.05 vs HA-UV.

2.3UVRAG調控胞內SA的復制 將SA(MOI=100)分別感染干擾及過表達UVRAG的HeLa細胞1、2、3、4、5 h，平板計數法計算胞內菌數量。結果顯示，干擾UVRAG使胞內菌數量顯著上升(P<0.05)，過表達UVRAG使胞內菌數量顯著下降(P<0.05)(圖5)。

3 討論

SA與自噬的相互作用具有其獨特的方式，SA通過降低細胞內cAMP的方式促進自噬[12]。SA產生的α-溶血素參與自噬通路的激活，并且阻止自噬體的成熟[13]。α-溶血素還可以誘導宿主細胞產生來自于吞噬體的絲管狀結構，而這些絲管似乎是SA胞內復制所必需的[14]。體內研究顯示自噬相關基因Atg16L1缺陷介導的對SA感染引起的膿毒癥和肺炎的易感性依賴于α-溶血素[15]。本研究用SA感染HeLa細胞1 h和2 h的LC3Ⅱ的表達量升高，感染3 h、4 h和5 h的表達量降低，SA感染細胞后LC3Ⅱ的表達量先升高后降低的趨勢與SA感染RAW264.7細胞引起LC3Ⅱ表達量的變化趨勢一致[16]。本研究SA感染HeLa細胞引起p62表達量的變化趨勢與SA感染NIH/3T3細胞引起的p62的表達量的變化趨勢一致[17]。此研究結果表明SA感染細胞后能夠引起并調控宿主細胞的自噬水平。

研究發現UVRAG能夠促進自噬體的形成與成熟[18]，之后有研究發現一些miRNAs可以靶向UVRAG，并且通過調控UVRAG的蛋白表達從而調控自噬[19]。本研究用SA感染HeLa細胞發現UVRAG的蛋白表達量升高，研究發現丙型肝炎病毒感染Huh7.5細胞也能夠引起UVRAG的蛋白表達量升高[20]。過表達UVRAG后感染SA LC3Ⅱ的表達量比未過表達UVRAG對照組的LC3Ⅱ的表達量升高，研究發現過表達UVRAG后感染結核分枝桿菌比未過表達UVRAG對照組的LC3Ⅱ的表達量升高[21]。過表達UVRAG后感染SA EGFP-LC3的點狀聚集比對照組的點狀聚集多，研究發現用Jurkat細胞過表達UVRAG后用激光共聚焦顯微鏡觀察點狀聚集升高[22]。此研究結果表明UVRAG可以調控SA感染誘導的自噬水平。

那么UVRAG能否調控SA的胞內復制？本研究發現過表達UVRAG后感染SA可以使胞內SA數量降低，而干擾UVRAG后感染SA可以使胞內SA數量升高。研究發現敲低BMDMs細胞感染結核分枝桿菌的胞內菌數量也升高[21]，另外研究發現過表達UVRAG后感染丙型肝炎病毒可以降低病毒的復制[20]。宿主細胞中某些蛋白參與了自噬介導的胞內SA的清除。研究發現磷脂酶C相關催化活性蛋白(PRIP)參與的自噬能夠清除SA感染非專職吞噬細胞[23]。SA感染非專職吞噬細胞后被WIPI-1陽性的自噬體樣囊泡包裹，而且這些WIPI-1陽性的囊泡會被溶酶體降解[24]。那么，宿主細胞中還有哪些蛋白參與了自噬介導的胞內SA的清除需要進一步挖掘探索。