二甲雙胍對小鼠急性肺損傷的保護作用及可能機制研究①

王貴佐 韓 冬 馬惠輝 尚文麗 張 薇 張永紅

(陜西省人民醫院呼吸與危重癥醫學科，西安 710068)

急性肺損傷 (acute lung injury,ALI)/急性呼吸窘迫綜合征 (acute respiratory distress syndrome,ARDS)是指由心源性以外的各種肺內、外致病因素導致的急性、進行性呼吸衰竭，目前ALI/ARDS的死亡率極高[1]，因此急需尋找新的治療方法。ALI/ARDS的發病機制包括氧化和抗氧化失衡[2]。在ALI/ARDS的發病中，肺組織內浸潤的炎癥細胞(中性粒細胞和肺泡巨噬細胞等)及肺泡上皮細胞等結構細胞可產生大量的活性氧 (reactive oxygen spec-ies,ROS)[2]；超氧化物岐化酶(superoxide dismut-ase,SOD)為體內重要的抗氧化酶，是體內清除ROS的關鍵酶之一，是機體抗氧化系統的重要組成部分。在感染、中毒和休克等環境因素作用下，SOD的表達及活性均顯著下降，造成ROS的清除能力明顯降低，進而導致氧化應激與抗氧化反應失衡[3]，ROS在體內增多可導致脂質的過氧化損傷，產生丙二醛(malondialdehyde，MDA)，還可導致蛋白質和DNA的氧化損傷，另外還可進一步激活NF-κB等信號通路，促進促炎介質的分泌，加重肺泡上皮細胞和肺血管內皮細胞的損傷[4,5]。因此重建氧化及抗氧化反應平衡是臨床治療ALI/ARDS的新方向。

二甲雙胍是臨床應用廣泛的口服降糖藥物，安全性較高。研究發現二甲雙胍預處理可降低動物模型肺泡毛細血管通透性，從而減輕呼吸機所致肺損傷[6]。最新研究發現二甲雙胍可能通過恢復AMPK依賴的mTOR抑制，在LPS誘導的ALI中發揮保護作用[7]。然而二甲雙胍能否通過重建氧化及抗氧化反應平衡，從而對ALI動物模型發揮保護作用尚待研究。本研究應用LPS誘導的ALI動物模型，評估二甲雙胍能否通過重建氧化及抗氧化反應平衡從而對ALI發揮保護作用。

1 材料與方法

1.1材料 BALB/c雄性小鼠由西安交通大學醫學部動物實驗中心提供。二甲雙胍由上海施貴寶制藥有限公司提供。脂多糖(Lipopolysaccharide (LPS)，Escherichia coli 055:B5)、HRP偶聯的羊抗兔二抗購于Sigma-Aldrich。兔抗鼠SOD1一抗購于Bioworld technology。MDA測試盒、SOD活力測試盒購于南京建成生物工程研究所。RIPA裂解液由武漢博士德生物工程有限公司提供。

1.2方法

1.2.1模型制作和實驗分組 6～8周齡BALB/c雄性小鼠 (20～25 g) 15只隨機分為3組：①對照組(Con),氣管內滴注無菌PBS 60 μl，作用24 h；②LPS模型組(LPS),氣管內滴注1 mg/ml LPS 60 μl，作用24 h；③二甲雙胍組(二甲雙胍預處理)(Met+LPS)，在氣管插管氣道滴注LPS前0.5 h給予二甲雙胍 (250 mg/kg) 腹腔注射，再氣管內滴注1 mg/ml LPS 60 μl作用24 h。小鼠均在西安交通大學醫學部動物中心SPF級動物房飼養，LPS氣道滴注24 h后處死小鼠。

1.2.2收集支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)及肺組織樣本 造模24 h后用10%水合氯醛0.8 ml/100 g腹腔注射處死BALB/c小鼠，用4℃預冷的無菌PBS 0.7 ml進行支氣管肺泡灌洗，重復灌洗3次，支氣管肺泡灌洗液的回收率達80%。BALF在4℃，1 000 g，離心10 min。分別收集上清和沉淀，BALF上清液在-80℃保存備用。細胞沉淀用無菌PBS重新重懸，利用細胞計數板進行細胞計數。取細胞沉淀涂片,晾干后進行瑞氏染色,進行中性粒細胞計數。支氣管肺泡灌洗后分離右肺組織并在-80℃保存。

1.2.3肺組織病理學檢查 取出分離后的左肺組織利用10%中性緩沖甲醛液固定,固定后對左肺組織進行脫水，透明，石蠟包埋后切片(5 μm),進行蘇木精-伊紅(HE)染色,觀察肺組織病理學改變。

1.2.4肺組織勻漿丙二醛含量測定 精密稱取各組小鼠肺組織，根據RIPA裂解液使用說明書制備肺組織勻漿，肺組織與RIPA裂解液的比例為1 mg∶7.5 μl，用玻璃勻漿器上下、旋轉充分碾磨。在冰上裂解1 h后，14 000 g離心20 min，取上清。肺組織MDA含量是機體脂質過氧化程度的標志，同時可以間接反映肺組織損傷程度。測定原理：MDA在高溫及酸性環境下可與2-硫代巴比妥酸(2-Thiobarbituric acid，TBA)反應，產生紅棕色的產物3,5,5-三甲基惡唑2,4-二酮，并且在532 nm處有最大吸收峰值。根據測試盒說明書操作，用分光光度計測定吸光度值，并通過如下公式算出待測樣品的MDA含量：肺組織中MDA含量(nmol/mg)=(測定OD值-對照OD值)/(標準OD值-空白OD值)×標準品濃度(10 nmol/ml)/待測樣品蛋白濃度(mg/ml)。

1.2.5肺組織勻漿SOD活力測定 實驗采用黃嘌呤氧化酶法(羥胺法)測定SOD活力，肺組織中SOD活力計算公式：肺組織勻漿中SOD活力(U/gHb)=(對照OD值-測定OD值)/對照OD值÷50%×反應液總體積/取樣量(ml)÷待測樣品蛋白濃度(mg/ml)。

1.2.6免疫印跡法檢測SOD1表達變化 精密稱取各組小鼠肺組織，根據RIPA裂解液使用說明書制備肺組織勻漿，肺組織與RIPA裂解液的比例為1 mg∶7.5 μl，用玻璃勻漿器上下、旋轉充分碾磨。在冰上裂解1 h后，14 000 g離心20 min，取上清，利用Western blot檢測各組小鼠肺組織SOD1表達的變化，SOD1應用GAPDH作為內參校正。

2 結果

2.1二甲雙胍對小鼠急性肺損傷肺組織病理改變的影響 如圖1所示，LPS模型組顯示內皮細胞和上皮細胞被嚴重破壞，肺出血及炎癥細胞在肺組織內大量浸潤，肺部正常的組織形態結構消失，二甲雙胍治療組顯著抑制LPS誘發的肺組織上述改變，對照組未見小鼠肺組織內明顯的炎癥反應。

2.2AMPK激動劑二甲雙胍對小鼠肺組織浸潤炎癥細胞數的影響 如圖2所示氣道內滴注LPS 24 h后，BALF內炎癥細胞數顯著升高(P<0.01，圖2A)，中性粒細胞計數顯著升高(P<0.01,圖2B)。而應用二甲雙胍預處理后，可顯著減輕LPS誘導小鼠急性肺損傷炎癥細胞的浸潤。

2.3二甲雙胍對肺組織脂質過氧化產物MDA含量影響 與對照組比較，LPS模型組中肺組織勻漿內脂質過氧化產物MDA含量(圖3)顯著升高，而應用二甲雙胍治療后的小鼠，MDA含量顯著下降，提示二甲雙胍具有抗氧化作用。

2.4二甲雙胍對小鼠肺組織SOD活性的影響 SOD活性反映肺組織抗氧化能力的強弱。如圖4所示，與對照組相比，SOD活性顯著下降(P<0.01)，應用二甲雙胍提前干預處理后，顯著逆轉 SOD活性下降(P<0.05)。提示二甲雙胍可提高SOD活性，從而對ALI發揮保護作用。

2.5二甲雙胍對小鼠肺組織SOD1表達的影響 SOD1是體內重要抗氧化酶，是體內清除氧自由基的首要物質，是機體抗氧化系統的重要組成部分。為探討二甲雙胍對肺組織保護作用是否通過上調SOD1的表達實現的，在氣管插管氣道滴注LPS前0.5 h給予AMPK激動劑二甲雙胍 (250 mg/kg) 腹腔注射。圖5所示，與對照組比較，免疫印跡結果顯示LPS模型組小鼠肺組織內SOD1的表達顯著降低(P<0.05)，應用二甲雙胍提前干預處理后，肺組織內SOD1表達較前明顯增加。提示二甲雙胍可增加肺組織SOD1的表達。

圖1 二甲雙胍對LPS誘導小鼠急性肺損傷病理改變的影響(HE染色，×200)Fig.1 Effect of metformin on pathological changes of LPS-induced acute lung injury in mice(HE staining,×200)Note:A.Control group；B.LPS model group;C.Met+LPS group.

圖2 二甲雙胍對小鼠肺組織浸潤炎癥細胞數的影響(n=3)Fig.2 Effect of metformin on inflammatory cell numbers in lung tissue of mice(n=3)Note: A.Total cells in BALF;B.Neutrophils in BALF.*.P<0.01 vs control group;#.P<0.01 vs LPS model group.

圖3 二甲雙胍對小鼠肺組織MDA的影響 (n=3) Fig.3 Effect of metformin on MDA in lung tissue of mice (n=3)Note: *.P<0.01 vs control group;#.P<0.01 vs LPS model group.

圖4 二甲雙胍對小鼠肺組織SOD活性的影響(n=3) Fig.4 Effect of metformin on SOD activity in lung tissue of mice (n=3)Note: *.P<0.01 vs control group;#.P<0.05 vs LPS model group.

圖5 二甲雙胍對肺組織內SOD1表達的影響(n=3)Fig.5 Effect of metformin on expression of SOD1 in lung tissue (n=3)Note: A.Result of Western blot;B.Expression of SOD1 in lung tissue was determined.GAPDH was used as loading control.*.P<0.01 vs control group;#.P<0.05 vs LPS model group.

3 討論

研究發現氧化-抗氧化失衡是急性肺損傷的重要發病機制之一[2]，在ALI/ARDS的發病中，ROS的產生顯著增多，ROS可導致脂質的過氧化損傷，DNA損傷及蛋白質失活，進而激活NF-κB 和activator protein 1信號通路，導致黏附分子、趨化因子和炎癥細胞因子的大量表達，導致細胞損傷及死亡[2]。在本研究中發現，在ALI動物模型中，脂質過氧化損傷的標志物MDA含量明顯增加，SOD活性顯著降低，以中性粒細胞為主的炎癥細胞在肺組織內大量浸潤，進一步證明氧化應激在ALI的發病機制中發揮重要作用。

研究發現二甲雙胍對LPS誘導的ALI動物模型發揮保護作用與激活AMPK信號通路有關[7]，另有研究發現二甲雙胍通過促進AMPK-α1在肺組織中的表達。從而減輕ALI期間的毛細血管損傷，對LPS誘導ALI模型發揮保護作用[8]。近年來研究發現二甲雙胍還能減輕多種因素導致的動物模型ALI[6,9,10]。提示二甲雙胍可能成為上述肺部疾病新的治療策略，然而二甲雙胍對上述疾病保護作用的具體機制尚待研究。

近年來研究發現增強抗氧化能力，進而抑制氧化應激成為干預ALI/ARDS的重要的策略之一。Yilmaz等[11]研究發現槲皮素(Quercetin)通過增加SOD的表達和增強SOD活性，對誤吸導致的大鼠ALI發揮保護作用。臨床研究發現ALI患者應用抗氧化劑乙酰半胱氨酸治療后，氧合指數明顯增加，同時減少了對呼吸支持的需求[12]。上述研究提示尋找藥物或其他物質來抑制增強抗氧化能力，進而減輕氧化應激可能是臨床治療ALI/ARDS的新方向。Kim等[13]研究發現白藜蘆醇通過激活AMPK可以上調SOD1的表達，抑制高血糖誘導的氧化應激和細胞凋亡，對糖尿病腎病模型發揮保護作用。因此二甲雙胍能否通過上調SOD1，并增強抗氧化能力減輕氧化應激，進而對LPS誘導的ALI/ARDS模型發揮保護作用值得研究。本研究發現，二甲雙胍可上調SOD1的表達，進而增加SOD的活性，減少脂質的過氧化產物MDA的產生，肺組織病理HE染色顯示，二甲雙胍抑制中性粒細胞為主的炎癥細胞在肺組織內的浸潤，減輕肺間質、肺泡內出血和肺泡結構的破壞，提示二甲雙胍對LPS誘導小鼠ALI/ARDS模型具有保護作用，這種保護作用可能與上調SOD1的表達，和增強SOD活性有關。本研究發現二甲雙胍可能通過重建氧化及抗氧化平衡，進而對ALI發揮保護作用。

二甲雙胍是一種體外合成的AMPK激動劑，多年來在臨床上廣泛應用于2型糖尿病的治療[14]。本研究提示二甲雙胍可通過重建氧化與抗氧化之間的平衡，從而為ALI/ARDS的治療提供新的策略。