TIPE3抑制CDDP誘導宮頸癌SiHa細胞凋亡及其機制研究①

姜召玲 王 洋 楊明浩 姜 杰 (煙臺通華醫院檢驗科，煙臺 264099)

TIPE(tumor necrosis factor alpha-induced protein 8,TNFAIP8)基因家族共有4個成員:TIPE、TIPE1、TIPE2與TIPE3，各成員間具有較高的同源性，在腫瘤及炎癥性疾病中發揮重要作用[1]。已有研究表明TIPE3作為癌基因在腫瘤的發生發展中起到促進腫瘤增殖及轉移的作用[2]。但到目前為止，TIPE3在宮頸癌中的生物學功能及其在宮頸癌治療中的作用尚不清楚。

宮頸癌在女性癌癥發病率中高居第四位，是女性癌癥主要死亡原因之一，也是最常見的女性生殖道惡性腫瘤[3]，鑒于我國宮頸癌高發病率及高死亡率的特點，發現新型治療靶點刻不容緩。目前宮頸癌的治療以手術、放療及新型輔助化療為主，順鉑(cis-diamminedichloroplatinum,CDDP)作為臨床治療常用化療藥物在宮頸癌的化學治療中發揮關鍵作用，但其耐藥性逐年增多[4]，找到導致其耐藥的靶向基因將為宮頸癌的化學治療提供有力手段。本研究旨在發現TIPE3抑制宮頸癌化療敏感性及其可能機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞株和慢病毒載體 人宮頸癌細胞系SiHa購自中國科學院上海細胞庫，細胞培養條件如下：培養基為含10%胎牛血清(FBS)的MEM，在37℃，5%CO2氣體條件恒濕培養。TIPE3慢病毒及干擾載體均購自上海吉凱基因化學技術有限公司，分裝并保存于-80℃超低溫冰箱備用。

1.1.2儀器與試劑 Aria2流式細胞儀購自美國BD公司，多功能酶標儀購自賽默飛有限公司(Vario skan Flash,Thermo,USA)；CCK8檢測試劑盒(C0037)及Annexin V-PI凋亡檢測試劑盒(C1052)購自上海碧云天科技有限公司；蛋白印跡使用PVDF膜購自美國Millipore有限公司；ECL顯影液購自Thermo fisher公司；順鉑(CDDP)購自齊魯制藥有限公司;MDR1抗體購自Bio-Legend公司(SIG-38730,Bio-Legend,San Diego,CA)；IL-6抗體購自Abcam公司(Ab9324);IL-6 ELISA檢測試劑盒購自南京森貝伽生物科技有限公司(SBJ-H0465)。

1.2方法

1.2.1RT-PCR檢測MDR1表達 利用Trizol試劑盒 (Invitrogen)對細胞總RNA進行提取，逆轉錄成cDNA后，PCR (TIANGEN,Beijing,China)檢測mRNA表達水平。引物序列如下:h-TIPE3,上游5′-GAGGAGCTGGTTATTGTGGAGAA-3′，下游5′-ATC-GGCAAAGTGGTTAAAGACG-3′;h-MDR1,上游5′-GAGGAATCTGGAGGAAGACATGACC-3′ ，下游5′-TCCAATTTTGTCACCAATTCC-3′;h-GAPDH,上游5′-AACGGATTTGGTCGTATTGGG-3′，下游 5′-CCTGGAAGATGGTGATGGGAT-3′。

1.2.2Annexin V/FITC和PI雙染法檢測CDDP誘導的細胞凋亡 人宮頸癌細胞系SiHa培養于含10%FBS的MEM培養基中，待細胞匯合度達80%時，用含EDTA濃度0.25%胰酶消化細胞，以密度1×106個/孔接種于6孔板中，待細胞貼壁后進行TIPE3過表達或干擾慢病毒轉染，24 h后加入50 μmol/L濃度的CDDP繼續作用24 h。檢測前用不含EDTA的胰酶消化細胞，PBS離心洗滌2次，Annexin V/FITC和PI雙染試劑盒進行標記染色，避光孵育15 min后，流式細胞儀上機檢測，實驗重復3次。

1.2.3Western blot實驗 接種于6孔板的人宮頸癌系SiHa培養于含10%FBS的MEM培養基中，待細胞匯合度達80%時，轉入TIPE3慢病毒載體及陰性對照，50 μmol/L濃度的CDDP繼續作用24 h后用含RIPA的蛋白裂解液提取細胞總蛋白，冰上裂解30 min，低溫高速離心去除沉淀，上清檢測蛋白濃度。蛋白樣品經垂直電泳、轉膜、封閉環節后，最后與TIPE3抗體、MDR-1抗體及IL-6抗體4℃孵育12 h，TBST洗膜3次，加入ECL顯影液進行膠片曝光檢測蛋白表達量，以GAPDH作為內參，實驗重復3次。

1.2.4ELISA實驗 收集細胞培養上清1 500 r/min離心20 min以徹底去除可能影響檢測的雜質，取上清50 μl進行ELISA實驗，并設陽性對照及陰性對照及空白對照孔。具體實驗步驟參照試劑說明書，最后用多功能酶標儀在吸光度450 nm處進行讀數，讀取各孔OD值；繪制標準曲線，計算培養上清中IL-6的濃度。

1.3統計學方法 采用Graphpad Prism7.0.軟件(GraphPad Software,San Diego,CA)進行t檢驗分析，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1TIPE3使宮頸癌細胞系SiHa IC50值明顯升高 宮頸癌細胞系SiHa轉入TIPE3過表達慢病毒載體及對照載體，以5×103個/孔細胞密度接種于96孔板中，待細胞貼壁后，各孔依次加入CDDP (濃度從0依次遞增至300 μmol/L)，繼續培養24 h，使用CCK-8試劑盒在OD450處測量該細胞對CDDP的IC50值(半數致死量)。IC50值計算方法為：(1-藥物處理細胞OD450/未處理細胞的OD450)×100%，使用GraphPad Prism 7.0計算CDDP的IC50值。結果發現轉染TIPE3過表達慢病毒的宮頸癌細胞系SiHa，經CDDP作用24 h后，其IC50值與對照組相比顯著增加，表明TIPE3對CDDP誘導的宮頸癌細胞凋亡有明顯抑制作用，差異具有統計學意義(圖1，P<0.001)。

2.2TIPE3抑制CDDP誘導的宮頸癌細胞系SiHa凋亡 基于上述結果，為進一步明確TIPE3在CDDP誘導宮頸癌細胞凋亡中的作用，TIPE3過表達宮頸癌細胞及對照組細胞以1×106細胞密度接種于6孔板中，待細胞貼壁后，加入50 μmol/L的CDDP處理24 h。用不含EDTA的胰酶常規消化細胞，用PBS以1 000 r/min速度離心洗滌細胞2次，Annexin V/FITC和PI雙染試劑盒進行標記染色后，流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。結果如圖2A顯示，與空白組(Blank)及轉染空載體組(Control)相比，TIPE3可顯著抑制CDDP誘導的宮頸癌細胞凋亡，差異具有顯著統計學意義(圖2A，P<0.001)。 同時，本課題組用TIPE3干擾慢病毒轉染宮頸癌細胞系SiHa，旨在從反向多水平檢測TIPE3在該現象中的作用。結果如圖2B所示，轉染TIPE3干擾慢病毒后，SiHa細胞在CDDP的誘導下凋亡明顯增多(圖2B，P<0.001)，以上結果進一步表明TIPE3可抑制CDDP誘導的宮頸癌細胞系SiHa凋亡。

圖1 TIPE3顯著增加SiHa細胞的IC50值Fig.1 TIPE3 significantly increases IC50 value for SiHa cells

圖2 TIPE3顯著抑制CDDP誘導的SiHa細胞凋亡Fig.2 TIPE3 significantly inhibits CDDP-induced SiHa cell apoptosisNote:***.P<0.001.

圖3 TIPE3顯著上調宮頸癌細胞中MDR1的表達水平Fig.3 TIPE3 significantly up-regulates MDR1 expression in cervical cancer cellsNote: ***.P<0.001.

2.3TIPE3明顯上調宮頸癌細胞中MDR1的表達 MDR1(P-gp)是導致腫瘤耐藥的主要分子之一，其功能主要是使抗腫瘤藥物外排增加，是多藥耐藥(multi drug resistance,MDR)形成的主要因素。如圖3所示，本研究發現過表達TIPE3后，與空白組(Blank)及轉染空載體組(Control)相比，不管是mRNA(圖3A)還是蛋白水平(圖3B)，宮頸癌細胞中MDR1表達量皆明顯上調。本課題組用TIPE3干擾慢病毒轉染宮頸癌細胞系SiHa，結果如圖3所示，轉染TIPE3干擾慢病毒后，SiHa細胞中MDR1mRNA(圖3C)及蛋白表達量皆明顯下調(圖3D)， 以上結果表明TIPE3可使MDR1蛋白表達升高，從而導致腫瘤耐藥的發生(P<0.001)。

圖4 TIPE3顯著上調宮頸癌細胞中IL-6的表達水平Fig.4 TIPE3 significantly up-regulation of IL-6 level in cervical cancer cellsNote: ***.P<0.001.

2.4TIPE3明顯上調宮頸癌細胞IL-6水平 有研究表明IL-6作為一種細胞因子參與了多種癌癥進展的過程，包括腫瘤生長、轉移和微環境免疫調節等[5]。有趣的是IL-6的過度表達可導致腫瘤細胞產生獲得性耐藥，表明針對IL-6的治療靶點可能成為逆轉腫瘤耐藥的新型策略[6]。本研究發現過表達TIPE3后，與空白組(Blank)及轉染空載體組(Control)相比，宮頸癌細胞培養上清(圖4A)及腫瘤細胞中(圖4B)IL-6表達量皆明顯上調。轉染TIPE3干擾慢病毒后，SiHa細胞培養上清(圖4C)及腫瘤細胞中(圖4D)IL-6表達水平則明顯下調。 以上結果表明TIPE3可使IL-6表達升高，進而也參與了腫瘤耐藥的發生過程(P<0.001)。

3 討論

多藥耐藥基因1(MDR1)編碼P-glycoprotein(又稱為ATP結合盒轉運蛋白B1，ABCB1)，該基因位于染色體7q21上[7]。 人類ABC轉運蛋白的一些成員如MDR1的主要功能是將各種化學治療藥物加速從腫瘤細胞泵出，從而賦予腫瘤細胞多藥耐藥(MDR)現象[8]。 盡管MDR1(P-gp蛋白)在腎臟、肝臟及胎盤等正常組織中皆有表達，但它在耐藥腫瘤中顯著過量表達，從而導致抗癌藥物無效和多藥耐藥的產生[9,10]。

TIPE3是最近發現的TIPE家族成員之一，目前對其功能的研究較少，它在人宮頸癌、結腸癌、肺癌和食道癌中的表達顯著增加，并且主要在分泌性上皮組織中表達[2,11]。機制上，它主要增強PI3K信號傳導和下游Akt信號傳導，敲低TIPE3會顯著減少動物模型中的腫瘤發生，過表達則會增加腫瘤發生，表明它在腫瘤生物學行為中行使癌基因功能[2]。在人類膠質母細胞瘤中，TIPE3抑制p38磷酸化并阻斷p38核轉位，通過調節p38 MAPK途徑并導致膠質母細胞瘤細胞存活[12]。有研究認為NF-κB和MAPK-ERK途徑與MDR1的表達調控密切相關[13]，因此我們認為TIPE3可能在腫瘤耐藥中也發揮重要功能。

本研究中，我們首次發現過表達TIPE3的宮頸癌細胞系SiHa對CDDP敏感性降低，主要表現為IC50值升高，該現象說明TIPE3可以抑制化療藥物對宮頸癌細胞的殺傷作用。Annexin V和PI實驗進一步發現過表達TIPE3后，腫瘤細胞對CDDP誘導的細胞凋亡率明顯降低。機制上，本課題組發現TIPE3可激活MDR1的轉錄表達，MDR1(P-gp)的主要功能是使腫瘤細胞中的抗腫瘤藥物外排增加[14]，從而導致化療藥物活性下降，是導致多藥耐藥的主要原因[15]。更有意思的是，我們發現過表達TIPE3后不管是細胞培養上清還是腫瘤細胞中IL-6水平皆明顯上調。IL-6是一種促炎癥細胞因子，通過整合多種細胞內信號通路參與多種生理和病理過程。IL-6的異常表達與多種腫瘤的生長、轉移和化療耐藥有關[16]。在過去幾十年中，盡管與診斷和治療方式有關的技術取得了顯著進展，但死于癌癥相關疾病的人數并沒有顯著減少。一般認為，腫瘤細胞釋放到微環境中的某些分泌因子除了促進腫瘤生長外，還具有使腫瘤細胞對化療和放療產生抵抗的能力。IL-6是腫瘤微環境中重要的細胞因子之一，在腫瘤耐藥中發揮關鍵作用[17]。本研究中發現TIPE3上調IL-6水平的現象，表明阻斷IL-6或抑制其相關信號通路或與常規抗癌治療相結合可能成為治療癌癥的潛在策略。

為進一步明確TIPE3在CDDP誘導宮頸癌細胞凋亡中的機制，本課題組用TIPE3干擾慢病毒轉染宮頸癌細胞系SiHa，旨在從反向多水平檢測TIPE3在該現象中的作用。結果顯示轉染TIPE3干擾慢病毒后，SiHa細胞在CDDP的誘導下凋亡明顯增多，MDR1及IL-6表達水平則明顯下調。該結果進一步表明TIPE3可使MDR1及IL-6表達增多，進而抑制CDDP誘導的宮頸癌細胞凋亡。 盡管目前宮頸癌的治療采用了聯合治療方法，但尚未得到滿意的臨床效果，本課題組前期發現TIPE也參與宮頸癌的發生發展過程[18]，因此現階段需要找到更多有效的參與因素，以改善患者治療效果。已有文獻發現TIPE3作為癌基因在人宮頸癌腫瘤組織中的表達顯著增加[2]，提示其在宮頸癌的發生發展中將發揮重要功能。本研究發現TIPE3在宮頸癌化學治療中發揮重要作用，為后續以TIPE3作為治療靶點，將對宮頸癌的診斷和治療、逆轉腫瘤多藥耐藥提供了理論可能和實踐基礎。