臨床前類風濕關節炎人群腸道菌群對造血和免疫系統影響的研究①

胡 丹 羅玉斌 趙 毅 劉 毅 (西南醫科大學附屬醫院風濕免疫科，瀘州 646000)

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種慢性系統性自身免疫性疾病，全球發病率為0.5%～1%[1]，目前發病機制尚不十分明確。許多研究學者認為主要與針對自身細胞結構的自身抗體生成相關，且這些抗體可在未出現關節炎臨床癥狀之前數年出現于患者血液中，提示觸發類風濕關節炎自身免疫的首發部位可能存在于關節外的其他黏膜部位，比如胃腸道或呼吸道[2]。歐洲抗風濕病聯盟2012年提出將RA相關遺傳風險因素階段、RA相關環境因素階段、RA相關系統性自身免疫階段、無臨床關節炎癥狀階段總稱為RA臨床前期，即Pre-RA[3]。有研究表明Pre-RA在無自身免疫性組織損傷情況下已存在免疫反應異常，如自身抗體(抗CCP抗體)水平異常，在遺傳和環境因素相互作用下啟動自身免疫反應，最終導致組織炎癥和損傷[4,5]。近年抗CCP抗體在黏膜免疫中的作用也受到人們的廣泛關注。有研究表明RA的始動源于機體黏膜系統，可在患者唾液中檢測到IgA型抗CCP抗體，表明口腔黏膜可能發生了局限性的抗環瓜氨酸肽反應(ACPA)[6,7]。故本實驗擬探究抗CCP抗體增加的人群其腸道菌群是否會影響腸道黏膜屏障和免疫系統。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑 FITC-conjugated dextran購于Sigma，SYTOTMBC Green Fluorescent Nucleic Acid Stain購于Thermo Fisher Scientific，PE anti-mouse IgA Antibody、Anti-Mouse CD19 APC、Ly6G:PerCP/cy5.5、BV421 Anti-Mouse CD127、PERCP-CY5.5 Anti-Mouse CD16/CD32、Anti-Mouse CD34 APC、PE CD117(ckit)mouse、Anti-Mouse Lineage FITC、PECY7 Anti-Mouse LY-6A/E(SCA-1)等抗體購于eBioscience公司。

1.1.2儀器 多功能熒光酶標儀購于BioTek公司，TCL-16高速離心機購于湘儀公司，流式分析分選儀購于BD公司，Leica病理圖像定量分析系統購于Leica。

1.1.3小鼠 6～8周齡DBA雌性小鼠，體重18～20 g，來源于四川大學華西臨床醫學動物實驗中心。

1.2方法

1.2.1菌液制備 2017年 11月至 2018年3月間在四川大學華西醫院風濕免疫科共收集45份糞便標本，其中 RA 患者組25份，ACPAs陽性健康人群組10份，健康對照組10份； 采樣時盡量做到早晨空腹收集標本，并保證環境清潔干燥，存放于-80℃冰箱。從-80℃冰箱取出糞便，放置于超凈臺，稱取0.6 g于5 ml EP管中。取1 ml 1×PBS于EP管中溶解糞便。向其中加入已消毒的磁珠，放置于振蕩器上充分振蕩攪勻。800 g離心3 min，取上清液用70 μm 的濾網過濾。得到的上清液用1×PBS稀釋成呈3 ml。

1.2.2抗生素處理小鼠 菌群移植前3 d，灌胃給予每只小鼠200 μl抗生素 (Vancomycin HLC、Neomycin sulfate、Metronidazole、Ampicillin)，連續處理3 d。

1.2.3菌群移植小鼠的建立 ①將29只抗生素處理過的DBA雌性小鼠分成三組，分別記為A組、B組、C組。A組(9只)為健康對照菌群移植組，B組(9只)為Pre-RA菌群移植組，C組(11只)為RA菌群移植組。②菌液保存在-80℃冰箱中，移植過程中需保存在冰袋中，移植當天記為第1天。③抗生素處理連續處理3 d后，每組分別灌胃給予菌液100 μl，隔一天移植一次。④在第14天，將A組、B組、C組禁食禁水4 h后灌胃給予FITC-conjugated dextran(0.6 g/mg)。4 h后小鼠進行麻醉，腹腔注射水合氯醛約150～200 μl/只。⑤留取標本：外周血用于檢測中性粒細胞比例，而血清用于檢測腸道通透性，脾臟用于B細胞檢測。骨髓細胞用于骨髓干細胞、B細胞、中性粒細胞檢測；小腸用于HE染色；糞便用于流式檢測腸道細菌包裹的SIgA；腸系膜淋巴結、腹股溝淋巴結、派氏淋巴結用于檢測B細胞。

1.2.4多功能熒光酶標儀檢測血清中FITC熒光強度(腸道通透性) 取100 μl的血清加入黑色96孔板，每組2個復孔，避光，每孔加入100 μl的PBS，輕輕吹打混勻，上機檢測血清中FITC熒光強度。

1.2.5糞便中腸道菌群IgA檢測 取1.2.2中50 mg 糞便標本于5 ml EP管中，加1 ml含有1%BSA的PBS溶液，4℃孵育1 h。將磁珠放入EP管中，放在振蕩器上振蕩攪勻，運行30 s，待其充分攪勻后離心10 min，吸取上清液，至新的離心管中。加入含有1%BSA的PBS溶液使樣品總體積為 1 ml，800 g離心5 min，棄去上清液，重復1次。再將1∶20 稀釋好的抗小鼠IgA抗體或同型對照50 μl樣品懸液中，避光4℃孵育20 min。加入1 000 μl含有1%BSA的PBS溶液，800 g 離心5 min，洗2次。然后將1∶400稀釋好的SYTO BC加入100 μl樣品懸液中，避光室溫孵育5 min。加入1 000 μl含有1%BSA的PBS溶液，800 g 離心5 min，洗1次。加入100 μl 含有1%BSA的PBS溶液和100 μl 8%多聚甲醛重懸樣品后上流式儀檢測。

1.2.6流式細胞術檢測不同部位淋巴結B細胞 將取出的淋巴結置于盛有PBS的培養皿中。淋巴結轉移到70 μm的篩網上，將篩網置于50 ml的離心管口，用5 ml注射器芯輕輕研磨淋巴結，不斷從培養皿中吸取PBS沖洗篩網。3 000 r/min離心5 min，棄上清。加入PBS輕輕吹打重懸細胞，分別取100 μl的細胞懸液于2管流式管中。抗體CD19檢測B細胞，4℃孵育20 min。BSA 200 μl/管，打勻，1 400 r/min離心5 min，倒掉上清，剩余50 μl，上機檢測。

1.2.7流式檢測骨髓干細胞、B細胞、中性粒細胞 分別取100 μl的骨髓細胞懸液于3管流式細胞管中，2 000 r/min離心5 min,棄上清。用Lin、Scal、c-kit、CD127、CD16/32、CD34檢測骨髓干細胞。用CD19檢測B細胞，Ly6G檢測中性粒細胞，避光4℃ 20 min。加入BSA 200 μl 清洗抗體，2 000 r/min 離心5 min，倒掉上清，剩余50 μl，上機檢測。

2 結果

2.1菌群移植后腸黏膜屏障及腸道通透性的改變 移植Pre-RA和RA人群菌液組小鼠腸道通透性明顯高于健康對照組，差異具有統計學意義(P<0.05)(圖1A)。同時，組織學HE染色發現移植Pre-RA和RA人群菌液組小鼠腸道黏膜受損，絨毛發育不良，且絨毛間間隙增寬，進一步證實腸道黏膜屏障被破壞(圖1B)，可致菌群及其代謝毒素可易位，影響機體健康。

2.2菌群移植后腸道SIgA包裹細菌的變化情況 腸內容物中SIgA的含量越高表明腸道中需要被中和的細菌就越多。實驗結果顯示，移植Pre-RA和RA人群菌液后，小鼠腸內容物中SIgA包裹細菌的含量不斷增加，且與移植健康對照組人群菌液相比差異具有統計學意義(P<0.05)。如圖2。

2.3菌群移植后骨髓造血干細胞及前體細胞的改變情況 結果表明，Pre-RA和RA人群腸道菌群主要影響髓系祖細胞(CMP)和粒單核細胞系祖細胞(GMP)。移植菌群后，移植Pre-RA和RA人群菌液組小鼠CMP和GMP均高于健康對照組，且移植RA人群菌液組差異具有統計學意義(P<0.05)。如圖3。

2.4菌群移植后外周血中性粒細胞的表達水平 由圖3可知Pre-RA和RA菌群移植組小鼠骨髓中粒單核細胞系祖細胞(GMP)增多，進一步觀察GMP分化成熟后的重要細胞類型即中性粒細胞的變化情況結果如圖4所示，移植Pre-RA和RA人群菌液組與健康對照組相比，小鼠外周血中性粒細胞也呈現相應增加的趨勢，且移植RA人群菌液組差異具有統計學意義(P<0.05)。

圖1 腸道通透性和小腸結構變化Fig.1 Intestinal permeability and small intestine struct-ure of miceNote: A.Fluorescence intensity.B.HE staining of small intestine.*.P<0.05.

圖2 小鼠糞便中SIgA包裹細菌的表達Fig.2 Expression of SIgA-encapsulated bacteria in mice fecesNote: *.P<0.05.

圖3 造血干細胞及各類前體細胞在骨髓中的比例Fig.3 Proportion of hematopoietic stem cells and various precursor cells in bone marrowNote: *.P<0.05.

圖4 小鼠外周血中性粒細胞比例Fig.4 Peripheral blood neutrophil ratio in miceNote: *.P<0.05.

圖5 不同免疫器官中B淋巴細胞的表達Fig.5 Expression of B lymphocytes in different immune organsNote: *.P<0.05.

2.5菌群移植后不同免疫器官中B細胞的表達情況 對脾臟、骨髓、派氏淋巴結、腸系膜淋巴結、腹股溝淋巴結等部位B淋巴細胞的比例進行了檢測。與移植健康人群菌液對照組小鼠相比 ，移植Pre-RA和RA人群菌液組小鼠脾臟B淋巴細胞增加，且差異有統計學意義(P<0.05)。而在小鼠派氏淋巴結部位，移植Pre-RA和RA人群菌液組小鼠B淋巴細胞較移植健康人群菌液對照組小鼠有升高趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)，如圖5。

3 討論

在易患RA的個體中，環境因素是誘發RA的重要因素之一。作為抗原來源的細菌和病毒成分可能誘導RA的發生，因此近年來它們作為潛在的致病因子備受人們關注。然而，迄今為止還沒有確鑿的證據表明微生物與RA的因果關系。

多種基因測序技術證實，RA患者腸道嗜血桿菌減少，乳桿菌豐度增加且這種改變與疾病的活動度以及自身抗體滴度相關，提示腸道菌群在RA發病中起著重要的作用[8]。抗CCP抗體或RF陽性在RA發病前十年即可檢出，而體外研究發現腸道菌群紊亂持續刺激機體可導致RF分泌增加[9]，表明抗CCP抗體或RF因子陽性而無關節炎癥狀的個體中，腸道菌群紊亂可持續存在并可能通過影響機體免疫系統反應，介導RA的發生[10]。前期研究證實在RA組、Pre-RA組、健康對照組三組中，腸道菌群發生了變化，在RA組普雷沃氏菌豐度增加，其中 Peptococcaceae、Gastranaerophilales、Coriobacteriaceae 等菌是和Pre-RA組共有的，兩組的益生菌屬Lachnoclostridium 菌屬豐度明顯低于健康對照組。

本研究發現來自Pre-RA和RA人群的腸道微生物導致小鼠腸道黏膜通透性增加及黏膜免疫反應失衡，說明可能RA相關的自身免疫和生物標志物的改變可能起源于黏膜部位，進而引起免疫系統失衡。有研究顯示特定黏膜位點的改變表明微生物因子可能會影響黏膜免疫反應，這在RA的早期發病機制中起著重要作用[11]。黏膜造成一定的破壞，使腸道黏膜通透性增加，引起菌群移位，在疾病的發展過程中起著誘導作用。

在內外源性不同抗原刺激腸道黏膜時，腸道黏膜會產生大量的分泌型SIgA，抑制病原體黏附于腸上皮的表面，阻止病原體與腸黏膜穿透進入腸道屏障，中和毒素且包裹有害病原體抗原。AS大鼠模型中腸道菌群失調，糞便中SIgA是由腸道中大量的細菌持續刺激腸黏膜后產生的，因此SIgA包裹細菌的表達能間接反映出腸道致病菌的數量[12]。本實驗與此結論相同，發現與健康對照組相比，移植Pre-RA人群腸道菌群的小鼠腸道屏障中SIgA的分泌增加，且RA組SIgA更高，因此失調的腸道菌群可通過一系列適應性反應激活產生SIgA的B淋巴細胞，最終導致SIgA的分泌增加，分泌的SIgA會進一步包裹腸道中致病菌，阻止其與腸道黏膜接觸定植，避免對免疫系統的激活，故腸內容物中SIgA包裹細菌的表達量增加。同時本實驗發現RA人群的菌群移植后CMP和GMP水平增加，外周血中性粒細胞增多，說明腸道菌群可通過影響造血干細胞及其前體細胞的發育而影響免疫細胞的早期發育。

Pre-RA階段自身反應性B淋巴細胞是免疫系統最明顯的改變，因為由其分泌的ACPA在Pre-RA階段即有異常[13]。B淋巴細胞存在于腸道相關淋巴組織中，包括派氏淋巴結、腸系膜淋巴結等。腸道微生物抗原和微生物代謝產物(SCFAs)會促進黏膜及其他部位漿細胞的分化，促進IgA的分泌[14]。在一項隨機雙盲試驗中發現單次向RA高風險人群注射1 000 mg利妥昔單抗，造成B淋巴細胞的耗竭可延緩RA疾病的發展過程，說明B淋巴細胞在臨床前階段(Pre-RA)發病機制中發揮重要作用[15]。而本實驗結果與此實驗結論相符，Pre-RA和RA組脾臟和派氏淋巴結部位B淋巴細胞明顯增加。 抗CCP抗體陽性的Pre-RA和RA人群的腸道菌群不斷刺激小鼠腸道黏膜，引起黏膜免疫反應，可通過外來抗原激活B淋巴細胞活化相關受體及其代謝產物直接調節B淋巴細胞活化，也可通過腸道上皮細胞、T淋巴細胞、骨髓細胞間接調節B淋巴細胞分化，導致派氏淋巴結和脾臟中B淋巴細胞增加。

此外，由于本實驗樣本量較少，還需擴大樣本進一步研究腸道菌群對外周免疫器官T細胞及T細胞亞型的影響，本研究只是初步探討腸道菌群在Pre-RA階段發展為RA階段的發病機制。

綜述所述，Pre-RA和RA人群腸道菌群使小鼠腸道黏膜通透性增加，引起腸道局部黏膜免疫反應，導致腸內容物中SIgA的分泌增加，且派氏淋巴結和脾臟中B淋巴細胞增加。腸道微生物已被證明在RA中發揮重要作用，盡管它們之間關聯的機制仍不明確，但本實驗說明腸道微生物在RA早期起著促進疾病發展的作用，為今后治療RA提供了新的思路。