新型冠狀病毒肺炎的臨床特征與病原體檢測

趙頌濤，毛 青

1.陸軍軍醫大學第一附屬醫院感染科，重慶 400038；2.武漢火神山醫院感染科，湖北武漢 430100；3.武漢火神山醫院綜合科，湖北武漢 430100

毛 青

新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)是一種由新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)引起的急性傳染病，傳播途徑主要為經呼吸道飛沫和接觸傳播，不排除通過氣溶膠和消化道等途徑傳播的可能性[1]。該肺炎傳染性極強，疫情在全球肆虐[2-3]。2020年1月20日，中華人民共和國國家衛生健康委員會將COVID-19納入法定乙類傳染病管理，采取甲類傳染病的預防、控制措施。截至2020年3月1日，全國累計報告COVID-19確診病例80 026例，累計死亡病例2 912例，給全國人民的身體健康帶來極大威脅，并使醫療衛生保障體系面臨嚴峻挑戰。本文就COVID-19的臨床特征及其病原體檢測研究進展進行如下綜述，以加強COVID-19防控意識，共同應對疫情。

1 臨床特征

1.1流行病學特征 基于目前的流行病學調查，COVID-19傳染源主要是SARS-CoV-2感染的病例，無癥狀感染者、潛伏期與恢復期病例也有一定的傳染性[4]。病毒潛伏期一般為1～14 d，多為3～7 d。呼吸道飛沫傳播和接觸傳播是主要的傳播途徑，長時間暴露于存在高濃度氣溶膠的相對封閉環境中也存在經氣溶膠傳播的可能，多例COVID-19患者糞便中檢測出SARS-CoV-2，提示存在糞-口傳播的可能性[5-6]，是否存在母嬰傳播等途徑有待進一步研究證實。從全國病例的年齡分布來看，各年齡段人群普遍易感，老年人和患有哮喘、糖尿病、心臟病等基礎疾病的人感染的風險可能增加。

COVID-19病例多數表現為普通型和輕型，少數病例病情進展較快，迅速進入重癥與危重癥階段，救治難度較大。截至2020年3月1日，全國COVID-19的病死率為3.6%。相對全國其他地區，武漢市的累計病死率較高，達到4.5%(截至2020年3月1日，武漢市累計確診病例為49 315例，累計死亡病例為2 227例)。WANG等[7]通過對138例單中心臨床住院病例進行回顧性分析，發現26.1%的病例由于并發急性呼吸窘迫綜合征、心律不齊、休克等，需轉入ICU進行治療，其中有6例死亡，病死率為4.3%。CHEN等[8]對金銀潭醫院收治的99例住院病例進行回顧性分析發現，17%的病例出現急性呼吸窘迫綜合征，3%的病例出現急性腎損傷，8%的病例出現急性呼吸損傷，在重癥病例的治療中，對9%的病例采取了連續腎替代治療(CRRT)，對3%的病例進行了體外膜肺氧合治療(ECMO)，總病死率為11%。WU等[9]對截至2020年2月11日的死亡病例進行分析，數據顯示危重癥病例的病死率為49%，且先前合并基礎疾病的病例病死率更高，在已死亡的病例中，10.5%合并心血管疾病，7.3%合并糖尿病，6.3%合并慢性呼吸系統疾病，6.0%合并高血壓，5.6%合并癌癥。

1.2臨床表現與分型 中華人民共和國國家衛生健康委員會在《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第七版)》(簡稱方案七)中指出，COVID-19病例的臨床表現以發熱、干咳、乏力為主。少數病例伴有鼻塞、流涕、咽痛、肌肉酸痛和腹瀉等癥狀。重癥病例多在發病1周后出現呼吸困難和(或)低氧血癥，嚴重者可快速進展為急性呼吸窘迫綜合征、膿毒癥休克、難以糾正的代謝性酸中毒、凝血功能障礙及多器官功能衰竭等。值得注意的是重型、危重型病例病程中可表現為中低熱，甚至無明顯發熱[10]。CHEN等[8]通過對99例病例的回顧性研究發現，發熱82例(83%)，咳嗽81例(82%)，呼吸短促31例(31%)，肌肉酸痛11例(11%)，同時具有發熱、咳嗽、呼吸短促這3項癥狀的有15例(15%)。

根據病情的嚴重程度，方案七將COVID-19分為4型[10]。(1)輕型：臨床癥狀輕微，影像學未見肺炎表現。(2)普通型：具有發熱、呼吸道等癥狀，影像學可見肺炎表現。(3)重型：成人符合下列任何一條，①出現氣促，呼吸頻率(RR)≥30次/分；②靜息狀態下，氧飽和度≤93%；③動脈血氧分壓(PaO2)/吸氧濃度(FiO2)≤300 mm Hg。高海拔(海拔超過1 000 m)地區應根據以下公式對PaO2/ FiO2進行矯正：PaO2/ FiO2×[大氣壓(mm Hg)/760]。肺部影像學顯示24～48 h病灶明顯進展>50%者按重型管理。兒童符合下列任何一條，①出現氣促，<2月齡，RR≥60次/分；2～<12月齡，RR≥50次/分；1～5歲，RR≥40次/分；>5歲，RR≥30次/分，排除發熱和哭鬧的影響。②靜息狀態下，氧飽和度≤92%。③輔助呼吸(呻吟、鼻翼扇動、三凹征)，發紺，間歇性呼吸暫停。④出現嗜睡、驚厥。⑤拒食或喂養困難，有脫水癥。(4)危重型：符合以下情況之一者，①出現呼吸衰竭，且需要機械通氣；②出現休克；③合并其他器官衰竭需ICU監護治療。

1.3影像學表現 鑒于病毒核酸檢測需采集標本、容易產生假陰性結果、檢測時間長等缺點，影像學檢查成為輔助診斷COVID-19快捷、方便的手段之一，并在判斷肺炎的嚴重程度中發揮重要作用。胸部X線片檢查對于病變處于早期，或以磨玻璃密度影為主要肺部特征改變的患者漏診率較高。CT，尤其是HRCT因空間分辨率較高，不受層面以外結構的干擾，通過后處理技術可多平面、多方位顯示病灶的細節，成為目前COVID-19的主要篩查和輔助診斷手段[11]。通過回顧性分析COVID-19患者的CT影像學資料，發現在COVID-19的早期、進展期、重癥期，肺部CT影像有不同表現[12-13]。

在COVID-19病變初期，病灶常分布于雙肺支氣管血管束和(或)胸膜下，以多發病灶多見，主要表現為小結節狀、多發斑片狀密度增高影。病灶內可出現穿行的增粗血管和厚壁支氣管，可伴有小葉間隔增厚[12，14]。在進展期，病灶范圍增大，逐漸融合，累及雙肺多個肺葉、肺段，呈“反蝶狀”分布。雙肺實變影增多，呈片狀或條索狀密度增高影，其內可出現支氣管充氣征。病灶境界不清，實性結節周圍可環繞磨玻璃樣滲出影而呈“暈征”改變，部分表現為“反暈征”。病變周圍小葉間隔可由于間質水腫而增厚，重疊于磨玻璃影上出現“鋪路石”征[11，13]。在重癥期，病例的CT表現為雙肺彌漫性分布的密度影，境界不清，病灶由小結節和斑片灶進展至以實性密度為主的病灶，大范圍實變，支氣管充氣征常見，呈“白肺”改變，見圖1[13，15]。

注：COVID-19病例，男，51歲，A為病程第2天，兩肺多發片狀磨玻璃密度影，內見增粗血管影；B為病程第5天，磨玻璃密度影范圍增大，可見增粗網格狀小葉間隔，呈“鋪路石”征；C為病程第9天，兩肺病變范圍進一步增大，密度增高，兩下肺呈“白肺”改變，雙側胸膜腔少量積液[15]。

圖1 重癥COVID-19病例肺部CT表現

2 病原體檢測

2.1SARS-CoV-2的研究現狀 冠狀病毒是一組有包膜的正義單鏈RNA病毒，屬巢病毒目(Nidovirales)、冠狀病毒科、冠狀病毒亞科，已知26種，并根據不同的抗原交叉反應和遺傳組成被分為4個屬(α、β、γ和δ)，其中α和β屬含有對人致病的毒株[16]。SARS-CoV-2屬于β屬冠狀病毒，有包膜，顆粒呈圓形或橢圓形，常為多形性，直徑為60～140 nm[17]。基因測序及序列分析顯示，其序列與蝙蝠的兩種冠狀病毒(bat-SL-CoVZC45與Bat-SL-CoVZXC21)的同源性達85%，與中國云南省蝙蝠攜帶的Bat SARSr-CoV RaTG13的相似度更高，甚至高達96.2%，故推測其演化路徑應是直接由蝙蝠傳播給人類[18-20]。電鏡下觀察到該病毒顆粒表面有獨特的9～12 nm大小的刺突，其刺突蛋白核酸與Bat SARSr-CoV RaTG13的相似度高達93.1%，序列相似度高達97.7%，推測這就是讓該病毒從蝙蝠傳播給人類的關鍵組分之一[18]。目前為止，發現SARS-CoV-2對人體適應良好，對紫外線和熱敏感，56 ℃ 30 min、乙醚、75%乙醇、含氯消毒劑、過氧乙酸和氯仿等脂溶劑均可有效滅活病毒，氯己定不能有效滅活病毒。

2.2標本取材及保存 《新型冠狀病毒肺炎病毒核酸檢測專家共識》(簡稱“共識”)指出，利用實時熒光反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測SARS-CoV-2核酸陽性可作為診斷COVID-19的直接證據[21]。因為SARS-CoV-2的基因結構與一般RNA差異較大，因此檢驗流程、檢驗質量和生物安全均需要一定的規范指導。標本采集人員必須經過院感管理部門或上級管理部門舉辦的生物安全培訓，并考核合格。對標本采集人員應按三級防護配備防護用品，包括工作服、防護服、一次性工作帽、醫用防護(N95)口罩、外科口罩、護目鏡、面罩、雙層手套、防水靴和鞋套[7-8]。配備防止病原微生物擴散和感染的設施，如處理感染性廢棄物的垃圾桶、處理緊急意外事件的藥品及用具，具備一定的通風條件等[22]。依據病情，采集的臨床標本種類包括呼吸道標本(首選肺泡灌洗液或氣道分泌物、深部咳痰液標本，其次是鼻拭子/咽拭子等)、血液、糞便(有腹瀉癥狀時)、眼部分泌物(有眼部感染時)等。標本的采集規范需參閱“共識”。采集標本后用75%乙醇溶液噴灑標本采集管外部，立即放入標有“生物危險”的密封袋中，并封嚴封口；再用75%乙醇溶液噴灑密封袋外部，然后放入標本轉運容器，并對轉運容器進行外部消毒，及時送檢。所有標本應盡快進行檢測，24 h內能檢測的標本可置于4 ℃保存，24 h內無法檢測的標本則應置于≤—70 ℃冰箱保存(若無≤—70 ℃冰箱，則應置于—20 ℃冰箱暫存)。血清可在4 ℃存放3 d，可在-20 ℃以下長期保存。所有種類標本應避免反復凍融。

2.3病原體的鑒定及結果判斷 針對SARS-CoV-2的實驗室檢測，國家發布了SARS-CoV-2的熒光PCR檢測引物和探針的實驗室檢測技術指南，推薦選用針對SARS-CoV-2的開放閱讀框1ab(ORF1ab)、核殼蛋白(N)基因區域的引物和探針[23]。引物與探針序列見表1。核酸提取和實時熒光RT-PCR反應體系及反應條件參考相關廠家試劑盒說明。

表1 實時熒光PCR檢測SARS-CoV-2的引物與探針序列

SARS-CoV-2的熒光PCR檢測引物和探針的實驗室檢測技術指南規定的結果判斷標準如下：陰性，無Ct值或Ct值≥40；陽性，Ct值<37，可報告為陽性；灰度區，Ct值為37～<40，建議重復實驗，若重復實驗結果Ct值<40，擴增曲線有明顯起峰，則該標本判斷為陽性，否則為陰性。如果用的是商品化試劑盒，則以廠家提供的說明書為準。

實驗室確認一例病例為陽性，須滿足以下條件：同一份標本中SARS-CoV-2兩個靶標(ORF1ab、N)特異性實時熒光RT-PCR檢測結果均為陽性。如果出現單個靶標陽性的檢測結果，則需要重新采樣，重新檢測。陰性結果也不能排除SARS-CoV-2感染，需要排除可能產生假陰性的因素，包括標本質量差，標本收集過早或過晚，沒有正確的保存、運輸和處理，技術本身存在的原因，如病毒變異、PCR抑制等[22]。

陳煒等[24]對4例確診COVID-19病例的咽拭子與痰液標本分別進行人體細胞GAPDH管家基因，病毒ORF1ab基因、N基因及S基因的實時熒光RT-PCR 核酸檢測，并進行比較，發現痰液標本中的病毒含量明顯高于咽拭子標本，說明痰液標本檢測效果優于咽拭子標本。郭元元等[25]對同一例病例不同時間點3份送檢標本的不同試劑檢測結果進行比較，以評價不同試劑盒性能，發現目前使用的SARS-CoV-2核酸檢測試劑盒均需要改進，篩查的準確性有待提高。

采用測序技術，尤其是高通量測序，又稱下一代測序(NGS)技術從患者體液和(或)血液標本中檢測出SARS-CoV-2核酸，也是COVID-19的確診指標[10]。采用NGS進行臨床標本病毒基因測序，與已知SARS-CoV-2的序列高度同源，便可確診為COVID-19。但鑒于與實時熒光PCR相比，NGS存在費用昂貴、檢測周期長等缺點，目前臨床未能廣泛開展NGS檢測。

鑒于核酸檢測的不足，聯合采用血清免疫學檢測可提高檢出率。ZHOU等[18]發現，SARS-CoV-2感染的血清學動態變化特點是當患者體內IgM水平開始下降時，IgG水平開始升高。ZHANG等[26]發現，在SARS-CoV-2感染第5天，血清IgM和IgG檢測的陽性率分別達到81%和100%，遠高于核酸檢測陽性率。邱峰等[27]報道多家生物公司研發出檢測SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體的膠體金試劑(免疫層析法)，這為SARS-CoV-2感染的輔助診斷和流行病學調查提供了可選擇的檢測手段。但鑒于血清學檢測存在一定的假陰性率與假陽性率，如用ELISA試劑盒對確診冠狀病毒(SARS)感染病例的血清標本進行檢測，發現在病程第1～10天，檢出率僅為40%，而在自身免疫性疾病患者中，可出現假陽性結果[28-29]，因此，確診COVID-19需聯合考慮患者的接觸史、臨床表現、病毒核酸檢測與血清學檢測結果等。

3 小 結

SARS-CoV-2是繼SARS、埃博拉病毒和禽流感病毒后又一嚴重危害人類公共衛生安全的新病毒，這使COVID-19在短時間內成為全球關注的焦點。從發現COVID-19至今，在不足3個月的時間內，其傳播速度和確診病例數遠超2003年的SARS感染規模，已成為全球性公共衛生關注事件，疫情防控形勢仍異常嚴峻。截至目前，人們對SARS-CoV-2的致病性、傳染性、宿主適應性及進化等的認識極為有限，尚欠缺針對該病毒的高特異度、高準確度的快速檢測手段。在臨床上，針對COVID-19的發病機制、診治方案、藥物研發等均處于初始摸索階段，均有待進一步深入研究。