核酸和血清學指標結(jié)合，多類型標本聯(lián)檢，提高新型冠狀病毒檢出率

魯 彥，居 軍，李德紅

1.中國人民解放軍96604部隊醫(yī)院檢驗科，甘肅蘭州730030；2.甘肅省人民醫(yī)院檢驗中心，甘肅蘭州 730099

魯 彥

新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)是由新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)引起的傳染性極強、主要經(jīng)飛沫和接觸傳播、不排除氣溶膠和消化道傳播可能的急性傳染病[1-3]。COVID-19臨床特征表現(xiàn)有發(fā)熱、干咳、乏力，少數(shù)患者伴有鼻塞、流涕、咽痛、肌痛和腹瀉等癥狀。重癥患者多在發(fā)病1周后出現(xiàn)呼吸困難和(或)低氧血癥，嚴重者可快速發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征、膿毒癥休克、難以糾正的代謝性酸中毒和出凝血功能障礙及多器官功能衰竭[1,3-6]。SARS-CoV-2屬于β屬的新型冠狀病毒，有包膜，顆粒呈圓形或橢圓形，常為多形性，直徑60～140 nm。SARS-CoV-2基因組的長度為29 881 nt(GenBank MN988668和MN988669，序列讀取存檔數(shù)據(jù)庫Bioproject登錄號PRJNA601736)。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，SARS-CoV-2與蝙蝠冠狀病毒BtCoV/4991(GenBank KP876546)的部分RdRp基因的核苷酸同源性達98.7%[1,7-8]。SARS-CoV-2基因特征與2003 年嚴重急性呼吸綜合征病毒(SARSr-CoV)和2012年的中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERSr-CoV)有明顯區(qū)別[1]。確診的患者和無癥狀隱性感染者是SARS-CoV-2的傳染源[3-4,9]。通過流行病學特征、臨床特征、影像學特點，以及反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)或基因測序檢測呼吸道分泌物、支氣管灌洗液、血液或者糞便標本中SARS-CoV-2核酸是確診SARS-CoV-2的主要依據(jù)[4]。測定SARS-CoV-2核酸常用的方法有RT-PCR、基因測序、恒溫擴增等，最常用的仍然是RT-PCR。不同品牌RT-PCR試劑檢測SARS-CoV-2的靈敏度有區(qū)別，不同類型標本檢出率不一致，對臨床癥狀明顯、影像學特點符合COVID-19，但核酸檢測陰性的患者，應增加標本種類、更換試劑品牌驗證SARS-CoV-2是否為陽性。鑒于目前核酸檢測有一定的漏診率，建議將核酸檢測和血清學檢測結(jié)合起來、增加檢測標本類型，采用不同品牌試劑盒檢測，可提高檢測的靈敏度，減少漏檢率，達到控制傳染源的目的。

1 核酸檢測在COVID-19診斷和治療中的意義重大

病毒的分離和培養(yǎng)是SARS-CoV-2檢測的金標準。人體感染后96 h左右呼吸道上皮細胞內(nèi)即可出現(xiàn)SARS-CoV-2，但體外分離培養(yǎng)需要6 d，且病毒的分離和培養(yǎng)對實驗室要求較高，需要在P4實驗室進行，絕大多數(shù)臨床實驗室達不到要求[10]。因此，病毒培養(yǎng)雖然特異度高，但對于疾病的早發(fā)現(xiàn)、早報告、早隔離、早治療意義不大。RT-PCR是檢測SARS-CoV-2核酸最重要的方法。目前，國內(nèi)批準的PCR試劑盒擴增的靶區(qū)分別為SARS-CoV-2基因組中開放讀碼框1a/b(ORF1ab)、包膜蛋白(E)和核衣殼蛋白(N)，見圖1[11]。有的試劑盒僅針對ORF1ab靶區(qū)(華大生物)，有的試劑盒針對ORF1ab、N基因兩個靶區(qū)(圣湘、達安基因)，有的試劑盒針對3個靶區(qū)(ORF1ab、N和E 3個區(qū)段，伯杰、捷諾、上海之江)。不同試劑盒的檢測靈敏度有區(qū)別(102～103copy/mL)，判讀應嚴格按照試劑盒說明進行[12]。CORMAN等[13]建議在常規(guī)工作流程中可將E基因檢測作為一線篩選工具，RdRp基因(位于ORF1ab靶區(qū)內(nèi))作為確診工具，也可直接單獨檢測RdRp基因。E基因檢測靈敏度高達3.2 RNA copy/反應 (95%可信區(qū)間為2.2～6.8 RNA copy/反應)，RdRP基因高達3.7 RNA copy/反應( 95%可信區(qū)間為2.8～8.0 RNA copy/反應)。N基因靈敏度稍弱[13]。通過特異性的RdRP-SARSr-P2探針可以有效區(qū)分SASrCoV，有較高的特異度。通過確診的198份標本驗證，未出現(xiàn)假陽性[13]。CHU等[14]研究則表明檢測臨床標本N基因的靈敏度比ORF1ab基因高10倍，可能的原因是臨床標本中的細胞被病毒感染后的亞基因組mRNA表達，導致樣品中有更多的N基因拷貝。根據(jù)檢測性能，建議將N基因檢測作為篩選試驗，ORF1ab基因檢測作為確診試驗。N基因陽性/ORF1ab陰性結(jié)果應視為不確定，建議將該標本轉(zhuǎn)至WHO參考實驗室進行進一步檢測[14]。總之，對患者標本進行核酸檢測的意義重大。

注：1a/b為閱讀框架1a/b；E為編碼包膜蛋白的基因；S為編碼刺突蛋白的基因；M為編碼膜糖蛋白基因；3/6/7a/8/9b為編碼輔助蛋白的基因3/6/7a/8/9b；N為核蛋白。

圖1 人類SARS-CoV-2和SARSr-CoV基因組示意圖[11]

1.1核酸檢測是確診和鑒別診斷SARS-CoV-2的重要依據(jù)，也是判斷療效的依據(jù) 核酸檢測技術(shù)具有可早期診斷且靈敏度和特異度高等特點[15]。從《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第一版)》到《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第七版)》，均將呼吸道標本或血液標本中RT-PCR檢測SARS-CoV-2核酸陽性作為重要的依據(jù)[3]。測定SARS-CoV-2核酸是與流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒感染等其他病毒感染進行鑒別診斷的重要依據(jù)。經(jīng)治療后，連續(xù)2次呼吸道病原體核酸檢測陰性(間隔≥24 h)是解除隔離出院的重要依據(jù)[4]。

1.2判斷病情嚴重程度 通過判斷不同標本病毒檢測結(jié)果可以判斷感染范圍。如咽拭子檢測病毒核酸為陽性而支氣管肺泡灌洗液檢測病毒陰性，提示病毒感染灶可能主要限于上呼吸道，患者病情比較輕，易康復[16]。患者肺泡灌洗液中SARS-CoV-2核酸滴度高、持續(xù)高病毒載量時間長(1周以上)，繼發(fā)暴發(fā)性心肌炎、左室射血分數(shù)下降、心室擴大的可能性大。對下呼吸道持續(xù)高滴度病毒患者要警惕重癥化，特別應警惕病程早期病毒所致的暴發(fā)性心肌炎風險[16]。血液中(血清或全血)檢測SARS-CoV-2陽性提示患者病情較重，應該引起足夠重視[17]。

2 不同種類標本和不同廠家RT-PCR試劑對SARS-CoV-2核酸檢測結(jié)果不一致

2.1不同類型標本PCR檢測SARS-CoV-2核酸的結(jié)果不一致 PCR方法靈敏度和特異度都比較高。根據(jù)《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第七版)》[4]，呼吸道標本或血液標本均可用于檢測SARS-CoV-2，但咽拭子、痰液、纖維支氣管鏡灌洗液、血液、肛門拭子、糞便標本PCR核酸檢出率不一致[17-19]，痰液標本、支氣管鏡灌洗液中病毒基因擴增曲線信號均比咽拭子強[19-20]。上述研究提示，在排除COVID-19病例或解除隔離時，單獨以咽拭子SARS-CoV-2核酸檢測陰性為依據(jù)需謹慎，必要時應當采集痰液等下呼吸道標本進行檢測。上呼吸道標本存在漏診的原因可能是SARS-CoV-2作用的靶點ACE2受體主要分布在肺泡Ⅱ型上皮細胞[21]。因此，下呼吸道標本陽性率高于上呼吸道；在留取上呼吸道的標本之前患者準備工作不到位(清理鼻腔、飲水等)也容易造成漏檢[21]。另一項研究表明，熒光PCR檢測15例確診的COVID-19患者不同標本中的病毒核酸，其中咽拭子陽性率為53.3%，肛拭子標本陽性率為26.7%，全血標本陽性率為40.0%，血清標本陽性率為20.0%，只有2例患者咽拭子和肛拭子標本均為陽性[17]，進一步提示單獨檢測某一種類標本中的核酸將造成一定的漏檢率。

2.2不同品牌PCR試劑盒檢出率有差異 有研究表明，同一患者咽拭子標本采用6種不同品牌國產(chǎn)PCR試劑盒檢測SARS-CoV-2結(jié)果有差異，6個品牌的試劑最低檢測限為500 copy/mL，檢測的基因均為OFR1ab和N基因，其中3個品牌試劑檢測不出OFR1ab，1個品牌試劑檢測不出N基因[22]。同時，不同品牌試劑批內(nèi)變異系數(shù)有差異，可能與不同品牌試劑盒引物設計不同、各位點檢測靈敏度不同有關(guān)[8]。因此，對于有明顯的臨床癥狀和(或)符合COVID-19影像學表現(xiàn)，但核酸檢測陰性的患者，可以考慮更換不同品牌的試劑盒進行檢測，以增加檢測的準確性，減少漏診。

3 血清學檢測SARS-CoV-2感染陽性率比較高，但需要進一步研究

有研究表明，在感染SARS-CoV-2后第5天，IgM和IgG陽性率分別為81%、100%。抗體檢測陽性率比核酸檢測陽性率(咽拭子：25.0%，肛拭子：37.5%)高[17]。因此，可以考慮動態(tài)監(jiān)測病毒IgM或IgG(4倍增長)，作為核酸檢測的補充手段。國家感染性疾病臨床研究中心、深圳市第三人民醫(yī)院(南方科技大學第二附屬醫(yī)院)、重慶醫(yī)科大學聯(lián)合博奧賽斯生物科技有限公司已研發(fā)出SARS-CoV-2血清學檢測試劑盒，通過驗證發(fā)熱7～14 d的COVID-19患者有較高的臨床符合率(IgM 和IgG均為 96.6%)。達安基因、珠海銀科等公司已研制出檢測SARS-CoV-2的化學發(fā)光免疫檢測試劑盒。甘肅省醫(yī)學科學研究院李克生教授團隊成功研發(fā)出SARS-CoV-2抗原金標檢測試劑盒，為SARS-CoV-2血清學檢測奠定了技術(shù)基礎。

血清學試劑盒最大的優(yōu)勢在于標本采集容易、標本處理和實驗操作簡單、測試時間短、速度快，適合用于大樣本量篩查。基于金標法、ELISA法、化學發(fā)光法的血清學試劑盒各有優(yōu)點。如金標法不需要特殊設備(甚至不需要離心機，將標本靜置待血細胞自然沉降，血清析出就可以檢測)，單個標本即可檢測，隨時采血隨時可以檢測，檢測的時間很短，20 min內(nèi)完成檢測，成本比較低，對于基層實驗室初步判斷是否為SARS-CoV-2感染有一定的意義；缺點是靈敏度和特異度沒有ELISA法和化學發(fā)光法高。ELISA法靈敏度超過金標法，操作時間為1～2 h，能夠批量測試，成本低，檢測速度快，適合在基層或大中型醫(yī)院使用。

4 將核酸檢測和血清學檢測結(jié)合，提高檢出率

鑒于目前SARS-CoV-2傳染性比較強，早發(fā)現(xiàn)、早報告、早隔離、早治療對于疾病的防控意義重大。核酸檢測由于有一定的漏診率，對SARS-CoV-2早發(fā)現(xiàn)、早隔離有一定的影響，因此，建議將血液標本抗體(抗原)檢測加入相關(guān)的診療指南，以彌補RT-PCR核酸檢測檢出率比較低，容易造成漏診的缺點。對于咽拭子RT-PCR核酸檢測陰性擬作解除隔離出院的患者，可以考慮同時再采集痰液標本、肛拭子標本通過RT-PCR檢測核酸，如均為陰性，再檢測血清IgM抗體是否轉(zhuǎn)陰，或者IgG抗體滴度是否不再增加，以作為核酸檢測補充手段。

由于目前血清學檢測SARS-CoV-2的研究報道非常少，因此，本文觀點具有一定的局限性，有待后續(xù)全國血清學檢測報道進行修訂。