芍藥苷預(yù)處理對(duì)肝缺血再灌注大鼠肝功能及線粒體損傷的影響*

黃 松,彭勝亮,盧 強(qiáng),徐國(guó)海,杜曉紅

南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院麻醉科,江西南昌 330006

肝缺血再灌注是肝移植、肝部分切除術(shù)等多種肝臟手術(shù)的必經(jīng)程序。研究證明,肝臟手術(shù)圍術(shù)期肝缺血再灌注容易誘發(fā)線粒體結(jié)構(gòu)完整性的破壞,導(dǎo)致呼吸鏈、內(nèi)外膜及基質(zhì)蛋白功能和ATP合成的抑制,從而誘發(fā)肝細(xì)胞的凋亡[1-2]。輕者致患者術(shù)后肝代謝、解毒功能降低,重者致肝衰竭乃至全身多臟器功能障礙,明顯增加了手術(shù)并發(fā)癥的發(fā)生率和病死率[3]。芍藥苷作為一類中藥,可通過多種機(jī)制改善腦缺血再灌注損傷[4],但其在肝臟缺血再灌注肝功能及線粒體損傷中的作用尚不清楚。因此,本研究擬評(píng)價(jià)芍藥苷預(yù)處理對(duì)肝臟缺血再灌注大鼠肝功能及線粒體損傷的影響,為臨床研究提供參考。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性SD大鼠64只,6～8周齡,體質(zhì)量250～300 g,由南昌大學(xué)動(dòng)科部提供。采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)法分為假手術(shù)組(S組)、肝缺血再灌注組(I-R組)、芍藥苷組(PF組)和生理鹽水組(NS組),每組16只。

1.2方法 按照參考文獻(xiàn)[5]采用Nauta法構(gòu)建大鼠70%肝臟缺血再灌注模型。腹腔注射氯胺酮麻醉,由上腹正中線切開進(jìn)腹,暴露肝臟,分離韌帶和系膜,顯露第一肝門。I-R 組用無創(chuàng)血管夾夾閉肝十二指腸韌帶致肝缺血60 min后松開血管夾恢復(fù)血流。操作過程中,夾閉血管時(shí)肝葉很快由鮮紅色轉(zhuǎn)變?yōu)榘导t色,松開血管夾后缺血的肝臟很快恢復(fù)成鮮紅色,說明肝臟缺血再灌注制備成功,遂關(guān)閉腹腔。S組僅解剖肝十二指腸韌帶,遂關(guān)閉腹腔；PF組于模型制備前7 d通過尾靜脈連續(xù)注射芍藥苷30 mg/(kg·d)，共7 d,其余處理同I-R組；NS組于模型制備前7 d通過尾靜脈連續(xù)注射0.9% NaCl注射液30 mg/(kg·d)，共7 d,其余處理同I-R組。

各組大鼠于再灌注6 h后再次麻醉,經(jīng)心臟采血5 mL,不加抗凝劑,靜置10 min,離心后取上層血清經(jīng)日立全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)。取大鼠肝右葉組織,采用DNA 斷裂的原位末端標(biāo)記(TUNEL)法測(cè)定肝細(xì)胞凋亡數(shù),操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。光鏡下進(jìn)行觀察,每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野(×400),計(jì)算總細(xì)胞和凋亡細(xì)胞,細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)=凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)/總細(xì)胞計(jì)數(shù)×100%,取其平均值。

另取部分肝組織,制備細(xì)胞懸濁液,過濾、洗滌、離心,制備單細(xì)胞懸液,利用熒光染料羅丹明123(Rh123)作為線粒體膜電位(△Ψm)的標(biāo)記物,采用流式細(xì)胞儀測(cè)定△Ψm。

余下部分肝組織提取肝組織線粒體后,采用Clark 氧電極法檢測(cè)線粒體呼吸功能(jieoulian 63),分別測(cè)算線粒體三態(tài)呼吸速率和四態(tài)呼吸速率(氧濃度降低值/實(shí)際時(shí)間),計(jì)算呼吸控制率(三態(tài)呼吸速率/四態(tài)呼吸速率)和磷氧比。

2 結(jié) 果

2.14組大鼠肝AI、AST及ALT的比較 與S組比較,I-R組、PF組、NS大鼠AI、ALT和AST水平明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；I-R組與NS組大鼠AI、ALT和AST水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與I-R組及NS組比較,PF組大鼠AI、ALT和AST水平明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 4組大鼠肝AI、AST及ALT的比較

注:與S組比較,*P<0.05；與I-R組比較,#P<0.05；與NS組比較,△P<0.05。

表2 4組大鼠線粒體呼吸速率、呼吸控制率、磷氧比及△Ψm的比較

注:與S組比較,*P<0.05；與I-R組比較,#P<0.05；與NS組比較,△P<0.05。

2.24組大鼠線粒體呼吸速率、呼吸控制率、磷氧比及△Ψm的比較 與S組比較,I-R組和PF組大鼠三態(tài)呼吸速率、呼吸控制率、磷氧比和△Ψm水平明顯降低,四態(tài)呼吸速率明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與S組比較,NS組大鼠三態(tài)呼吸速率、呼吸控制率、磷氧比、△Ψm和四態(tài)呼吸速率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與I-R組比較,PF組大鼠三態(tài)呼吸速率、呼吸控制率、磷氧比和△Ψm水平明顯升高,四態(tài)呼吸速率明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與NS組比較,I-R組和PF組大鼠三態(tài)呼吸速率、呼吸控制率、磷氧比和△Ψm水平明顯降低,四態(tài)呼吸速率明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

3 討 論

肝臟缺血再灌注損傷是臨床常見的病理過程之一,各種原因引起的休克、肝臟大手術(shù)時(shí)的肝門阻斷、肝移植等均可以引起肝臟缺血再灌注損傷。肝臟缺血再灌注既可以引起肝細(xì)胞凋亡,也可以引起肝細(xì)胞壞死。本研究采用國(guó)內(nèi)外廣泛認(rèn)可的Nauta法構(gòu)建70%肝臟缺血再灌注模型[6],結(jié)果顯示,與S組比較,I-R組血清ALT和AST的水平明顯升高,光鏡下肝組織病理學(xué)損傷明顯,肝AI明顯升高,提示肝臟缺血再灌注損傷模型制備成功。

ALT主要存在于肝細(xì)胞質(zhì)內(nèi),其細(xì)胞內(nèi)水平高于血清中1 000～3 000倍,是反映肝臟細(xì)胞功能最敏感的指標(biāo)[7]。AST主要存在于肝細(xì)胞線粒體內(nèi),當(dāng)肝臟發(fā)生嚴(yán)重壞死或破壞時(shí),肝細(xì)胞線粒體受到損傷時(shí),AST從線粒體中釋放出來,才能引起AST在血清中水平偏高[7]。肝AI是肝細(xì)胞凋亡數(shù)與肝細(xì)胞總數(shù)的比值,反映肝細(xì)胞的凋亡情況。本研究結(jié)果證明肝臟缺血再灌注會(huì)造成肝功能的下降及肝細(xì)胞的凋亡,而經(jīng)芍藥苷預(yù)處理后,肝功能的下降和肝細(xì)胞的凋亡明顯得到好轉(zhuǎn)。

線粒體通路在細(xì)胞凋亡中起著重要作用。線粒體呼吸速率是線粒體功能的一項(xiàng)指標(biāo),線粒體四態(tài)呼吸是當(dāng)線粒體內(nèi)ADP耗竭,點(diǎn)子傳遞線粒體的耗氧量下降的呼吸狀態(tài),若此時(shí)加入ADP后線粒體的點(diǎn)子傳遞得以順利進(jìn)行,耗氧量增加,即為三態(tài)呼吸,因此,可以通過這兩個(gè)階段線粒體呼吸狀態(tài)的耗氧率的比值來描述線粒體呼吸功能的強(qiáng)弱[8]。而磷氧比是線粒體在每消耗1 g原子氧的同時(shí)能夠產(chǎn)生ATP的量,是表現(xiàn)線粒體氧化磷酸化耦聯(lián)程度的指標(biāo),能夠體現(xiàn)線粒體的能量轉(zhuǎn)化效能。本研究結(jié)果證明肝缺血再灌注將造成肝細(xì)胞線粒體功能受損,而芍藥苷預(yù)處理能改善此種情況。

△Ψm是衡量線粒體功能的重要指標(biāo)之一,能夠最直接地反映線粒體的能量狀態(tài),和線粒體的Ca2+攝取、ATP生成、蛋白質(zhì)和代謝物的轉(zhuǎn)運(yùn)及ROS的生成密切相關(guān)[9]。△Ψm降低誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡,近年來引起密切關(guān)注。當(dāng)PTP開放時(shí),相對(duì)分子質(zhì)量<1.5×103的物質(zhì)即可通過,內(nèi)膜兩側(cè)離子梯度消失,△Ψm崩潰和電子傳遞脫耦聯(lián),線粒體膜通透性升高,釋放促凋亡因子,可通過激活caspase-9及caspase-3引起級(jí)聯(lián)反應(yīng)。核酸內(nèi)切酶徹底破壞細(xì)胞生命活動(dòng)所必需的全部基因,caspase會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)的全面解體,完成細(xì)胞凋亡[10]。因此,△Ψm的崩潰是細(xì)胞凋亡的早期事件。研究表明,與熒光分光光度法及激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)方法相比,流式細(xì)胞術(shù)可更準(zhǔn)確地測(cè)定△Ψm,且操作簡(jiǎn)便[2]。

綜上所述,芍藥苷預(yù)處理能在一定程度上改善肝缺血再灌注造成的肝功能及線粒體損傷,相關(guān)具體機(jī)制及信號(hào)通路本研究團(tuán)隊(duì)正在進(jìn)行下一步的研究。