PCR檢測技術(shù)在真菌性角膜炎快速診斷中的應(yīng)用*

王 俊,王 宇,2,彭柿杰,馮 濤,唐衛(wèi)東

1.攀枝花學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗科,四川攀枝花 617000；2.攀枝花學(xué)院醫(yī)學(xué)院,四川攀枝花 617000

真菌性角膜炎是由各種真菌引起的角膜病變,早期診斷困難,嚴重者可致盲[1]。快速診斷真菌性角膜炎有助于臨床的診治,以及患者眼球和視力的恢復(fù)。本研究通過比較革蘭染色鏡檢、真菌培養(yǎng)和聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)3種檢測方法在診斷真菌性角膜炎中的優(yōu)缺點,探討PCR檢測技術(shù)在真菌性角膜炎的快速診斷中的應(yīng)用價值,現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集攀枝花學(xué)院附屬醫(yī)院2016年1月至2018年12月收治的502例疑似感染性角膜炎的患者為研究對象,其中男320例,女182例；年齡1～87歲,平均(53.36±18.56)歲。

1.2儀器與試劑 革蘭染液和乳酸酚棉蘭染液均購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司；沙保羅平板購自鄭州安圖生物有限公司；實時熒光定量PCR儀、電泳儀和凝膠電泳成像系統(tǒng)購自美國伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司；核酸提取試劑盒購自廣東凱普生物科技股份有限公司；PCR引物的合成和測序均由蘇州金唯智公司完成。

1.3方法 眼科醫(yī)生根據(jù)患者臨床癥狀和病史,進一步做裂隙燈和激光共焦顯微鏡檢查,對出現(xiàn)角膜潰瘍患者刮取角膜分泌物分別做革蘭染色鏡檢、真菌培養(yǎng)和PCR檢測。

1.3.1革蘭染色鏡檢 由眼科醫(yī)生無菌操作刮取患者角膜病變部位組織,制成涂片,自然干燥后火焰固定,然后進行革蘭染色,最后采用油鏡進行鏡檢。

1.3.2真菌培養(yǎng) 取涂片的同時,將角膜分泌物分別接種于兩塊沙保羅平板,分別放置于28 ℃和35 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d,每天觀察,長出可疑菌落進一步做乳酸酚棉蘭染色鑒定。

1.3.3PCR檢測 (1) PCR引物設(shè)計,參考文獻[2],選擇內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1 (ITS1)和內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)4(ITS4)為真菌通用型引物,分別為5′-TCC GTA GGT GAA CCT GCG-3′和5′-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3′。因為菌種的差異,ITS1和ITS4可擴增出500～600 bp不等的片段。(2)真菌DNA的提取,將清洗液1.0 mL加入標本中,振蕩；將振蕩均勻的液體轉(zhuǎn)至1.5 mL離心管,以13 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min,棄去上清液；再次加入1.0 mL清洗液,振蕩重懸,以13 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min,棄去上清液；將核酸提取液100 μL加入沉淀,重懸,將提取固形物1管加入后,高速渦旋振蕩5 min后,瞬時離心；然后置95 ℃干浴2 min,馬上冰浴5 min,立刻以13 000 r/min離心5 min,上清液即為PCR反應(yīng)的模板(保存溫度—20 ℃)。(3) PCR反應(yīng),用上述提取的真菌DNA為模板,用真菌通用引物擴增相應(yīng)的片段。反應(yīng)體系:25 μL Mix溶液、1.5 μL上/下游引物、1 μL模板DNA,雙蒸餾水加至50 μL。反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min,55 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取擴增產(chǎn)物5 μL做1%瓊脂糖凝膠電泳,觀察是否有特異性擴增條帶。(4)PCR擴增產(chǎn)物分析,電泳后,如果有目標帶出現(xiàn),則純化PCR產(chǎn)物,外送測序。電泳出現(xiàn)陽性結(jié)果,則登錄Gen-Bank,使用 Blast對測序結(jié)果進行同源性比對,進而鑒定菌株。如果是同一屬,序列同源性大于97%；如果是同一種則大于99%；如果是陰性結(jié)果則不會出現(xiàn)特異性擴增條帶。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析。計數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示,多組間比較采用χ2檢驗,多組間的兩組比較采用Fisher確切概率法比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1革蘭染色鏡檢結(jié)果 502份角膜分泌物革蘭染色鏡檢檢出陽性28例,檢出率為5.6%。

2.2真菌培養(yǎng)結(jié)果 502份角膜分泌物真菌培養(yǎng)檢出陽性24例,檢出率為4.8%,檢出真菌種屬見表1。

表1 PCR檢測和真菌培養(yǎng)結(jié)果[n(%)]

2.3PCR檢測結(jié)果 用ITS1和ITS4對502例疑似患者的角膜分泌物標本直接進行PCR檢測,擴增結(jié)果見圖1。擴增出的目的片段約500 bp。共檢出陽性30例,檢出率5.9%,檢出真菌種屬見表1。PCR檢測結(jié)果為陽性的30例患者中，23例為農(nóng)民(76.7%),7例為非農(nóng)民(23.3%)；15例為男性(50.0%),15例為女性(50.0%)。PCR檢測結(jié)果為陽性的30例患者中，革蘭染色鏡檢28例陽性,真菌培養(yǎng)24例陽性。

2.43種方法檢測結(jié)果的比較 502份角膜分泌物中,PCR檢測的檢出率最高,為5.9%(30/502)；革蘭染色鏡檢檢出率次之,為5.6%(28/502)；真菌培養(yǎng)檢出率最低,為4.8%(24/502)。但三者比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.722,P=0.697)。

注：M為DNA標記物；4、11為陰性結(jié)果；1～3、5～10、12、13為陽性結(jié)果。

圖1 PCR擴增結(jié)果

3 討 論

PCR檢測出的菌株中,鐮刀菌屬最多,為70.0%,曲霉菌屬次之,為10.0%,與某些國內(nèi)報道的鐮刀菌屬占63.2%,曲霉菌屬占14.1%等數(shù)據(jù)接近[3-6]。30例PCR檢測結(jié)果陽性的病例中:23例為農(nóng)民,占檢出人群的76.7%；男女患者各15例,各占50.0%,與胡衛(wèi)萍等[7]報道的男性患者占67%和女性患者占33%略有不同。我國大于60%的真菌性角膜炎的發(fā)生與角膜植物外傷史密切相關(guān)[8]。自然環(huán)境中廣泛存在鐮刀菌屬和曲霉菌屬等植物致病性真菌[9],農(nóng)民由于頻繁地從事農(nóng)業(yè)生產(chǎn)活動,角膜容易被植物葉子及枝條等劃傷，引起真菌性角膜炎可能性更大[10]。

近年來,真菌性角膜炎感染發(fā)生率增加了數(shù)倍,呈明顯上升趨勢[11],由此導(dǎo)致角膜穿孔的風(fēng)險也比細菌性角膜炎高出5～6倍[12],同時也增加了患者手術(shù)風(fēng)險[13-15],及早診斷和治療顯得尤為關(guān)鍵。但是目前,真菌性角膜炎的早期診斷面臨重重窘境:首先,真菌性角膜炎早期臨床表現(xiàn)不具有典型特征,容易與細菌或阿米巴等微生物引起的角膜炎混淆,導(dǎo)致出現(xiàn)誤診。其次,傳統(tǒng)的實驗室檢查,如革蘭染色鏡檢和真菌培養(yǎng)難以做到既快速又準確。革蘭染色鏡檢簡單、快速[16-17],可多部位多次取材,提高檢出率,缺點是不能將所見真菌準確鑒定到種屬,臨床醫(yī)生只能經(jīng)驗性治療,容易延誤病情。真菌培養(yǎng)物染色后,采用顯微鏡觀察菌絲和孢子仍然是診斷真菌性角膜炎的金標準[18-19],有助于醫(yī)生合理治療,但需耗費2～7 d,甚至更長的時間,同時標本受污染的風(fēng)險較高。

PCR檢測技術(shù)以準確、快速、特異、敏感和標本用量少等優(yōu)點受到臨床一線工作者的青睞,研究者們也嘗試用分子生物的手段對真菌性角膜炎進行快速診斷。本研究中,革蘭染色鏡檢、真菌培養(yǎng)和PCR檢測的檢出率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),PCR檢測和真菌培養(yǎng)檢測的真菌種屬比較,差異也無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),表明PCR檢測的檢出率及對真菌種屬的鑒定能力可與另外兩種方法媲美,且PCR檢測的優(yōu)勢更加突出:數(shù)小時內(nèi)直接將標本中少量真菌初步鑒定到屬或種,大大縮短了檢測周轉(zhuǎn)時間(TAT),能盡快給臨床醫(yī)生提供準確診斷的依據(jù)和有效治療的方向,既讓患者及時得到最佳的治療,也為患者節(jié)省了醫(yī)療費用,同時減少了真菌耐藥性的發(fā)生。但是,對非致病性DNA的擴增可造成過度診斷[20],不應(yīng)將PCR檢測作為常規(guī)診斷真菌性角膜炎的唯一方法,可聯(lián)合其他方法提高診斷的準確性。本研究中,PCR檢測的檢出率偏低,可能與醫(yī)生的取材、患者在入院之前就自行使用各種滴眼液和積累的分析數(shù)據(jù)量不夠大等有密切的關(guān)系,具體原因有待進一步探討。

綜上所述，PCR檢測、革蘭染色鏡檢和真菌培養(yǎng)3種方法對真菌性角膜炎的檢出率無明顯差異,但PCR 檢測的時效性有明顯優(yōu)勢,在快速診斷方面具有廣闊前景。