冷凍分離技術在腫瘤標志物質控品研制中的應用*

石建新,蔣 英,段桂開,于 飛,林惠玲

1.廣東省深圳市福田區慢性病防治院檢驗科,廣東深圳518048；2.廣東省深圳市婦幼保健院檢驗科,廣東深圳 518028

腫瘤標志物的檢測在輔助診斷腫瘤、觀察療效等方面具有重要意義,做好室內質控(IQC)是確保腫瘤標志物檢測結果能否發出的前提條件,而質控品又是IQC的關鍵因素,目前國內腫瘤標志物質控品多使用進口產品,但由于進口腫瘤標志物質控品成本高昂,訂貨周期長,而國產質控品又存在價格偏高、質量參差不齊的情況,導致腫瘤標志物檢測IQC難以規范進行。為節約質控成本,提高檢測質量,很多學者開始進行自制質控品的相關研究[1-4],但在質控品制備方法上還存在高值質控品原料難以收集、添加劑過多、制備成本偏高等問題,針對這些問題,本研究以甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、總前列腺特異性抗原(TPSA)為例,探索采用冷凍分離法進行腫瘤標志物質控品的制備是否可行,現報道如下。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑 儀器為美國貝克曼DxI 800自動分析儀,配套檢測試劑均采用美國貝克曼公司產品。配套質控品采用美國BIO-RAD質控品。乙二醇(AR級)為天津永大公司提供的分析純試劑。

1.2方法

1.2.1質控血清的制備 除溶血、黃疸、乳糜血標本外,每天收集臨床實驗室AFP、CEA、TPSA水平升高,同時乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、丙型肝炎病毒(HCV)、人類免疫缺陷病毒(HIV)和梅毒項目檢測結果均為陰性的剩余血清標本,置于-20 ℃冰箱保存。當收集到足夠血清后統一混勻,采用離心機以3 000 r/min離心10 min,經過濾處理后,剩余血清放在-20 ℃冰箱冷凍保存24 h,再靜置于4 ℃冰箱緩慢解凍,期間不能搖動,待全部解凍后緩慢吸取上3/4血清單獨分裝,作為低值質控血清原液,剩余1/4的血清作為高值質控血清制備的原液。分別混勻后取樣測定其AFP、CEA、TPSA水平，并觀察是否達到目標水平,如未達目標水平,可將分離血清放置于-20 ℃冰箱再進行冷凍處理,重復上面的冷凍分離步驟,直到血清原液達到目標水平。分別在高、低值質控血清原液中加入適量30%乙二醇,然后通過高、低值血清原液配比來進行最終調節,最后制成符合要求的質控品,并用0.2 μmol無菌過濾器進行過濾。以0.5 mL為單位,用無菌西林瓶將自制質控品進行分裝,封口保存于-20 ℃冰箱備用。

1.2.2性能評價方法 所有檢測均是在儀器保養后,對測試項目進行重新校準,并在BIO-RAD質控品處于在控條件下進行。(1)均勻性測定[4]:根據國家CNAS-GL03檢測方法,隨機取10支自制質控品,依次編號后分別按1～10和10～1的次序檢測AFP、CEA、TPSA項目2次,通過檢測結果計算出F值。若得到的F值小于F臨界值(α=0.05),則表明樣品是均勻的,樣品間和樣品內差異無統計學意義(P>0.05)。(2)穩定性測定[4]:根據國家CNAS-GL03檢測方法,質控品制好后,隨機取6支自制質控品,每支重復檢測AFP、CEA、TPSA項目2次,以此作為各項目即刻均值,再分別在第1、3、6、9、12個月隨機取6支自制質控品,參照以上同樣的方法進行測定,再分別取各項目均值與其即刻均值比較,若計算得到的t值小于t0.05(10),說明樣品之間差異無統計學意義(P>0.05),樣品是穩定的。

1.3統計學處理 采用SPSS19.0統計軟件進行數據處理及統計分析,采用獨立樣本t檢驗和單因素方差分析法進行比較,以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1均勻性測定 結果見表1。

表1 自制不同水平腫瘤標志物質控品均勻性測定結果(ng/mL)

表2 自制不同水平腫瘤標志物質控品穩定性測定結果

2.2穩定性測定 將自制質控品保存1、3、6、9、12個月測定的均值分別與即刻測定得到的均值進行比較,差異無統計學意義(P>0.05)。 見表2。

3 討 論

腫瘤標志物是腫瘤細胞本身存在或分泌的特異性物質,絕大多數存在于惡性腫瘤中,血清中腫瘤標志物的檢測對腫瘤預警及早期診斷具有重要的科學意義[5-6]。在實驗室質量管理體系中,IQC是一個重要環節,而質控品是保證IQC工作的重要物質基礎。國家《臨床實驗室定量測定室內質量控制指南》中明確指出,實驗室可以進行質控品自制。理想的質控品通常應具有以下特征:人血清基質，無傳染性，添加劑的數量盡可能少，瓶間變異小和穩定時間長[7]。其中穩定性和均勻性是評價質控品的主要指標[3]。

本研究結果顯示,自制腫瘤標志物質控品的均勻性和穩定性良好。均勻性檢測得到的F值均小于F臨界值[F0.05(9,10)=3.02],說明樣品間和樣品內差異無統計學意義(P>0.05),樣品是均勻的；自制質控品在第1、3、6、9、12個月測定的均值分別與即刻測定的均值比較,計算的t值均小于t0.05(10)(1.812),說明樣品之間在1年以內差異無統計學意義(P>0.05),樣品是穩定的。自制質控品均勻性和穩定性符合相關要求[4,7]。

在質控品的制備方式上,本研究利用實驗室內剩余血清,結合冷凍分離法自制了腫瘤標志物質控品,避免了基質效應的干擾；在傳染性檢測方面,本研究直接收集臨床上HBsAg、HCV、HIV和梅毒項目檢測結果均為陰性的剩余血清標本,節省了質控品傳染性檢測的制備成本；制備成液體質控品而非固體干粉質控品減少了樣品復融帶來的瓶間差異；自制腫瘤標志物質控品解凍后外觀清澈透明,未見明顯渾濁及沉淀出現,穩定性和均勻性良好,能夠滿足IQC工作要求。同時,本研究主要探討利用冷凍分離法制備腫瘤標志物質控品,這和以往傳統的通過人為添加高、低值質控品原料來調節自制質控品水平的方式有所區別[8-9],能夠減少質控品制作成本和基質效應的影響。冷凍分離法是一種通過利用冷能將溶液的溶質以固相形式析出,并從液相中逐漸分離,以達到使溶液凈化或者濃縮目的的方法,其主要原理是利用冷能對溶液溶質遷移的影響,冷凍溫度越接近冰點時,血清中固液界面向前推移的速度就越慢,溶液溶質就有足夠的時間進行遷移擴散,最終使大量的溶質聚集在很小的體積內,致使濃度急劇增大[10]。國內外多項研究曾對冷凍分離技術進行過相關研究[11-13],但目前主要還是用于海水淡化和食品工業等領域,本研究探索將該技術用于腫瘤標志物質控品的制備,以解決一般醫院高值質控品血清原料難以獲取的問題。本研究結果顯示,利用冷凍分離技術能夠制備出符合要求的腫瘤標志物質控品，該方法具有操作簡單、原料來源方便、不需要特殊設備、成本低廉等優勢,而且對血清成分不易造成破壞,適合在各級醫院推廣使用。