白色念珠菌的快速檢測技術開發*

石星亮,余一海,陳 靜,譚有將,梁德智

1.廣東省佛山市順德區北滘醫院檢驗科,廣東佛山 528311；2.廣東省佛山市順德區創新設計研究院,廣東佛山 528311；3.廣東省佛山市順德區墨賽生物科技有限公司,廣東佛山 528311

近年來,真菌感染，尤其是侵襲性真菌感染的發病率呈逐年上升趨勢,而白色念珠菌作為條件致病菌,是臨床上最常見的致病菌。但是,目前檢測白色念珠菌主要以常規培養為主,此過程耗時費力,且檢出率相對較低。因此,快速、準確地從臨床標本中檢測白色念珠菌對疾病的早期診斷及治療極為重要。本研究開發了一種能快速準確檢測臨床血清中的白色念珠菌抗原的方法,現報道如下。

1 材料與方法

1.1標本來源 100份健康體檢者的血清標本及10份經熒光PCR核酸擴增法確認的白色念珠菌陽性的標本為廣東省佛山市順德區北滘醫院臨床送檢標本。

1.2儀器與試劑 白色念珠菌單克隆抗體及抗原購自廣州萬翎生物科技有限公司；羊抗鼠IgG購自洛陽市佰泰科生物技術有限公司；紅色微球購自上海輝質生物科技有限公司；NC膜(型號HF135)購自美國Milipore公司；白色念珠菌標準菌株ATCC10231購自廣東環凱微生物科技有限公司；其他化學試劑為分析純或者化學純。 美國BioDot公司 XYZ3060三維噴點平臺購自百道貿易(上海)有限公司。

1.3方法

1.3.1紅色微球標記抗體結合墊制備 參考文獻[1]的方法制作時間分辨熒光抗體結合墊,于相對濕度(RH)為30%～40%的環境下保存備用。

1.3.2包被抗體NC膜制備 參考文獻[1]的方法制作NC反應膜,于RH為30%～40%的環境下保存備用。

1.3.3試劑卡組裝 參考文獻[1]的方法制作檢測的試劑卡，放入鋁箔袋中,加入干燥劑,密封后于2～8 ℃保存備用。

1.3.4標本檢測 取80 μL臨床血清標本,滴加到檢測試劑卡中,試劑卡常溫反應10 min,如果同時出現T線和C線,則為陽性；如果僅出現C線則為陰性。

1.3.5性能評估 使用空白血清將白色念珠菌抗原經過一系列梯度稀釋后進行檢測以評估其最低檢測限；在空白血清中分別加入熱帶念珠菌、克柔氏念珠菌、曲霉、新生隱球菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、青霉、毛霉、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌、淋病奈瑟菌、醋酸鈣不動桿菌、肺炎克雷伯菌、甲型副傷寒沙門氏菌、乙型副傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌、產氣桿菌、枸櫞酸桿菌,系列稀釋抗原進行檢測以評估其有無交叉反應。使用試劑條檢測100份健康體檢者的血清標本及10份經熒光PCR核酸擴增法確認的白色念珠菌陽性的標本,評估其靈敏度和特異度。靈敏度=真陽性/(假陰性+真陽性)×100%,特異度=真陰性/(假陽性+真陰性)×100%。

1.4統計學處理 采用SPSS23.0軟件進行數據處理及統計分析,計數資料以例數或百分率表示,比較采用配對χ2檢驗和Kappa一致性檢驗,以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1最低檢測限 使用健康體檢者血清將白色念珠菌標準菌株ATCC10231進行一系列稀釋,當稀釋水平為100、101、102、103、104、105、106cfu/mL時,結果分別為-、-、-、-、+、+、++,見圖1。

圖1 檢測卡的最低檢測限測試

2.2交叉反應 在健康體檢者血清中分別加入熱帶念珠菌、克柔氏念珠菌、曲霉、新生隱球菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、青霉、毛霉、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌、淋病奈瑟菌、醋酸鈣不動桿菌、肺炎克雷伯菌、甲型副傷寒沙門氏菌、乙型副傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌、產氣桿菌、枸櫞酸桿菌,利用試劑條進行檢測,檢測結果均為陰性。

2.3檢測性能 使用試劑條檢測了100份健康體檢者(熒光PCR核酸擴增法檢測陰性)的血清標本及10份經熒光PCR核酸擴增法確認的白色念珠菌陽性標本,檢測結果見表1,靈敏度為80.00%,特異度為97.00%。經配對χ2檢驗,熒光PCR核酸擴增法與本研究方法檢測結果差異有統計學意義(P<0.05)；經一致性檢驗結果顯示,Kappa值為0.737,在0.40～0.75范圍內,兩種方法一致性一般。

表1 檢測卡的準確性測試(n)

3 討 論

真菌檢驗方法包括直接涂片鏡檢、真菌培養鑒定、真菌藥物敏感試驗、真菌感染組織活檢、真菌的免疫學試驗及分子生物學檢測等。 各種方法都有其各自的優缺點:直接鏡檢法快速、直接、成本低,但是檢出率較低,已無法滿足臨床的需求[2-3]；活組織檢查法對確診有很大的幫助,但是該方法對臨床醫生的技術水平要求較高,無法在基層醫院進行推廣[4-5]；真菌培養雖然為深部真菌感染的確診實驗,但是該法的培養陽性率低,在播散性念珠菌病血培養陰性患者中可高達50%,故診斷應結合涂片鏡檢、組織活檢、血清學和分子生物學檢查結果[6]；血清學檢測,如3-β-D葡聚糖試驗(G試驗)和半乳甘露聚糖試驗(GH試驗)是近年來發展起來的一種新的檢驗技術,得到了快速的應用,血清學檢測靈敏度和特異度均在80%以上。但血清學診斷假陽性、假陰性結果普遍存在,故不能僅憑血清學試驗結果作為確診的依據[7]；分子生物學檢測是近年發展最為迅速的檢測方法,有研究采用肽核酸熒光原位雜交技術(PNA-FISH)對血培養陽性的白色念珠菌和(或)光滑念珠菌進行檢測的靈敏度和特異度分別為99%～100%和100%[8-10],但是由于成本等種種原因,該方法還不能在國內進行大力推廣,也限制了它的使用。因此,成本較低、準確性較高的真菌檢測技術則有被市場認可及開發的前景。

白色念珠菌是臨床最常見的機會性感染病原體[11-14]。本研究中快速測試卡的最低檢測限為104cfu/mL,最低檢測水平較低,可以降低假陰性率,避免出現漏檢；無交叉反應,不受其他真菌和細菌的影響。王縛鯤等[15]報道的檢測方法靈敏度和特異度分別為71.1%和96.0%,而本研究中的白色念珠菌快速檢測卡檢測靈敏度和特異度分別為80.00%和97.00%,靈敏度和特異度都得到一定提高,同時降低了漏診率和誤診率。本研究中有2例假陰性、3例假陽性,說明本研究中的方法還是存在漏檢和誤檢,有必要通過熒光PCR核酸擴增法進行檢測。兩種方法測定結果差異有統計學意義(P<0.05),Kappa值未能達到0.75,未能達到較好的判斷標準,表明本研究中的方法與熒光PCR核酸擴增法仍存在差距，但由于本研究開發的快速檢測卡可以在10 min內對白色念珠菌作出檢測,具有方便、快捷的優勢。本次研發通過優化快速檢測卡標記過程中的每一個細節,檢測結果靈敏度、特異度較高,適合應用于臨床快速檢測,能夠滿足臨床醫生的檢驗需求,值得向臨床推廣。

本次研發過程采用了醫院、研究院、公司三方聯合研發的模式,在保證研發質量的同時,又可保證研發的實用性,提高研發效率,節約成本。