素食人群與非素食人群腸道菌群分布對比分析*

曾釗宇,劉蘭星,張 宇,駱恒芳,宋海濤,潘成明,胡森安,陳 梅

廣東省佛山市高明區人民醫院檢驗科,廣東佛山 528500

自2003年人類微生物組計劃啟動以來,已經發現人體腸道中棲息約1 000多種細菌,稱為腸道菌群,主要包括腸桿菌、腸球菌、擬桿菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌等菌屬,其數量約為一個健康人體細胞數的10倍,其編碼的基因數量超過人體所編碼基因的100倍[1-2]。它們通過菌群活動、代謝產物等來影響機體的代謝情況,以維持人體內環境穩態[3]。它們相互之間保持穩定平衡狀態,卻又容易受到宿主年齡、遺傳背景、膳食結構、生活環境及抗菌藥物治療等的影響,以上因素可導致腸道菌群在數量、結構、菌群豐度及生理狀態方面表現出明顯的差異[4-5],它們之間的這種差異受到國內外研究者的廣泛關注。腸道菌群是一類作用非常廣泛的互利共生微生物,在疾病的發生、發展及治療過程中發揮著不可替代的作用?？赏ㄟ^腸道特定微生物或菌群結構組成的變化來揭示腸道菌群、宿主與環境之間的相互關系。腸道菌群與肥胖[6]、代謝性疾病[7]、炎癥性腸病[8]、免疫失調疾病、傳染性疾病[9]及癌癥[10]等關系密切,腸道微生態在上述不同疾病中的作用方式不盡相同,并與病情發展、治療方式及治療效果聯系密切。同時,這種差異也提示不同患者在疾病治療、康復過程中應采取個體化的營養和藥物治療策略[11],通過不同的膳食模式來改變腸道不同菌群的豐度和分布,進而改善人體的新陳代謝,促進患者康復,甚至可能在降低疾病、癌癥的發生率方面發揮作用[12-13]。由于歷史的淵源,宗教的影響,人們觀念的轉變,全球69億人口中有2.5%是素食者[13]。據新華社報道,中國素食人口已經超過5 000萬[14]。2018年在《自然》雜志發表的一篇論文中,以色列魏茨曼研究所發現,人體腸道菌群的組成主要取決于飲食和生活方式,遺傳因素的作用非常小,飲食與腸道菌群之間相互影響,相輔相成[15]。本研究通過對素食人群與非素食人群的腸道菌群作對比,找出兩者之間的差異。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇50例素食者納入研究組,素食者定義為不吃任何動物食物的人,且素食飲食時間超過6個月,其中男15例,女35例；年齡28～73歲,平均(43.20±9.92)歲。50例非素食者納入對照組,非素食飲食時間超過6個月,其中男15例,女35例；年齡26～71歲,平均(41.10±8.97)歲。兩組研究對象年齡及性別構成比比較,差異均無統計學意義(P>0.05),具有可比性。所有研究對象均無胃腸道疾病病史,采樣前1個月均未使用抗菌藥物、微生態活菌制劑和瀉藥。

1.2儀器與試劑 MicroScan WalkAway40全自動細菌鑒定及藥敏儀，以及其配套鑒定板,需氧培養箱,厭氧培養袋,pH試紙,加樣器,EMB瓊脂平板(主要含有酩蛋白樣的氨基酸混合物、酵母浸液、適量的無機鹽、0.04%的伊紅Y、0.006 5%的美蘭和供做試驗的糖),PSE瓊脂平板(主要含蛋白胨、酵母浸粉、牛膽汁物、氯化鈉、枸櫞酸鈉、枸櫞酸鐵銨、疊氮化鈉、七葉苷等),改良MRS瓊脂平板(主要含蛋白胨、牛肉膏粉、酵母粉、玉米淀粉、無水酸鈉、枸櫞酸鈉、葡萄糖、乳糖、硫酸錳、無水酸鎂等),BBE瓊脂平板(主要含胰蛋白胨、大豆胨氯化鈉、牛膽粉、七葉苷、枸櫞酸鐵銨、氯化血紅素、慶大霉素),LBS瓊脂平板(主要含酵母浸粉、胰酪蛋白胨、磷酸二氫鉀、硫酸亞鐵、硫酸鎂、葡萄糖、乙酸鈉、枸櫞酸銨、硫酸錳等),瓊脂平板均購自上海科瑪嘉微生物技術有限公司。

1.3方法

1.3.1標本采集 采用滅菌小棒挑取自然排出的新鮮糞便,放入無菌容器,30 min內送檢。

1.3.2稀釋 取8支無菌試管,編為1～8號,每管加入0.9 mL生理鹽水,稱取新鮮糞便0.1 g于1號試管中,振蕩混勻,配成稀釋度為10-1的糞便混懸液；從1號管取0.1 mL糞便混懸液加入2號管,振蕩混勻,配成稀釋度為10-2的糞便混懸液；再從2號管取0.1 mL糞便混懸液加入3號管,振蕩混勻,配成稀釋度為10-3的糞便混懸液；按此方法連續稀釋至8號管,得到稀釋度為10-1至10-8共8個水平的糞便混懸液。

1.3.3腸道菌群的分離培養及鑒定 在各個稀釋度的糞便混懸液中取0.05 mL,用分區劃線方法分別接種至血瓊脂平板(計算菌落總數)和選擇性瓊脂平板上,腸桿菌用EMB瓊脂平板,腸球菌用PSE瓊脂平板,雙歧桿菌用改良MRS瓊脂平板,擬桿菌用BBE瓊脂平板,乳酸桿菌用LBS瓊脂平板進行分離培養。需氧菌(37 ℃)培養18～24 h,厭氧菌(37.5 ℃)培養24～48 h(厭氧培養),如無細菌生長,繼續培養至1周。

1.3.4糞便pH值測定 將pH值試紙插入糞便中,30 s內讀取結果。

1.3.5細菌形態觀察及鑒定 觀察平板菌落純度及形態,涂片革蘭染色觀察菌株的純度及菌落形態,然后將菌株接種至3 mL接種液(經高壓消毒的去離子水),至少制成相當于Mc-Fsrland 3標準液但不高于Mc-Fsrland 5標準液的渾濁懸濁液。然后,用加樣器在含有基底的每一個孔和2個控制孔中加入50 μL細菌懸浮液。將已接種的鑒定板放置在MicroScan WalkAway40細菌鑒定與藥敏儀中,35～37 ℃的條件下孵育24 h。記錄鑒定板相應細菌的鑒定結果數據。

1.3.6菌落計數 活菌集落單位=(標本質量+稀釋量)/標本質量×稀釋度×菌落個數。菌落數量經對數換算,以濕重log10CFU/g表示。

2 結 果

2.1兩組腸道細菌數量比較 研究組與對照組細菌總數比較,差異無統計學意義(P>0.05)。研究組乳酸桿菌、雙歧桿菌、腸桿菌數量明顯少于對照組,差異有統計學意義(P<0.05)。兩組擬桿菌與腸球菌數量差異無統計學意義(P>0.05)。見表1、2。

表1 兩組腸道細菌數量比較

表2 兩組腸道細菌的方差分析結果

注:SS為離均差平方和；DF為自由度；MS為均方。

2.2兩組研究對象的糞便pH值比較 研究組的pH值明顯低于對照組,差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 兩組研究對象的糞便pH值比較

3 討 論

本研究分析了兩個群體,研究組(n=50)為素食者，對照組(n=50)為非素食者,為了保證兩組間的差異最小化,對年齡和抗菌藥物使用等因素進行了一些限制。本研究結果顯示,腸道菌群數量最多的為乳酸桿菌,雙歧桿菌次之,這說明腸道菌群大多數以厭氧菌為主。研究組的糞便標本細菌總數與對照組相比,差異無統計學意義(P>0.05),研究組糞便中的乳酸桿菌、雙歧桿菌和腸桿菌明顯少于對照組(P<0.05),腸球菌與擬桿菌差異無統計學意義(P>0.05)。

本研究結果還顯示,研究組的pH值明顯低于對照組,這與研究組長期進食高碳水化合物和高纖維含量食物有關。研究組腸道菌群有助于宿主消化食物,菌群分泌的外酶對食物的降解會產生大量的短鏈脂肪酸,如醋酸酯、丙酸酯、丁酸鹽等,這些脂肪酸使腸道形成酸性環境,導致pH值長期保持在5.5～6.5的同時,又反過來影響細菌的生長,如腸桿菌科細菌更喜歡在pH值>6.5的環境中生長,所以素食人群腸桿菌數量明顯少于非素食人群。

國外研究學者發現,除了年齡、性別、飲食等因素外,微生物相互作用于不同腸道間的物質轉運、不同細菌的定植密度和營養物質的供應,硫酸鹽、膽汁酸及細菌的適應性都可能與腸道微生物菌群的組成和活性相關,這也是導致素食人群雙歧桿菌數量相對較少的原因之一[16-17]。另外,素食人群缺少蛋奶制品的攝入,可能導致乳酸桿菌和雙歧桿菌等腸道益生菌進入人體機會的減少,這也是素食人群的乳酸桿菌和雙歧桿菌數量較少的原因。

非素食人群有充足蛋奶制品的攝入,腸桿菌更喜歡蛋白質作為主要能量來源,這也解釋了腸桿菌在對照組中含量較高的原因。在非素食性飲食中,細菌能通過蛋白質的水解來增加腸道的pH值。

乳酸桿菌和雙歧桿菌是人體腸道主要的益生菌,腸道益生菌數量減少可能會導致機體抗病能力的下降,從腸道益生菌數量的角度來看,非素食飲食更有利于健康。素食人群可通過服用微生態活菌制劑或適量增加蛋奶制品的攝入來增加腸道益生菌的數量,以增強人體的抗病能力。

腸道菌群受到年齡、遺傳背景、膳食結構、生活環境及抗菌藥物治療的影響,飲食是影響腸道菌群的一個重要因素。目前，對不同飲食習慣的人群使用常規的微生物培養方法對其糞便菌群的研究只發現了一小部分的差異,因為腸道菌群大部分都是厭氧菌,常規微生物培養方法只能培養鑒別出小部分的腸道細菌,隨著分子生物學檢測技術的出現,現在可更快速、敏感、準確地檢出腸道細菌,這也是筆者下一步努力的方向。此外,人類對腸道菌群的研究幾乎都是依賴于檢測糞便標本,而糞便標本不能完全反映腸道菌群的狀況,但利用糞便標本調查腸道菌群的好處是顯而易見的,標本易獲得,對研究對象無創。與國外的研究相比,本研究樣本均來自中國人,得出的數據更有參考價值。但本次研究的樣本量少,說服性不夠,還需要更多的獨立試驗來證明本研究結論。