社區肺炎鏈球菌感染藥敏分析及分子生物學分型*

向 蓉,黃雪珍,莫和國,徐 寧

南方醫科大學附屬小欖醫院檢驗科,廣東中山 528415

肺炎鏈球菌是革蘭陽性菌、α溶血的兼性厭氧菌。可引起侵襲和非侵襲性疾病,如社區獲得性肺炎、中耳炎、腦膜炎和敗血癥等[1]。在20世紀80年代以前,青霉素是治療肺炎鏈球菌感染的一線用藥,由于耐青霉素肺炎鏈球菌的產生,到了20世紀90年代,一線用藥改為紅霉素。然而,隨著抗菌藥物的廣泛使用,大環內酯類耐藥的菌株趨于流行。根據相關報道,肺炎鏈球菌對β內酰胺類和大環內酯類藥物的耐藥率居高不下,多重耐藥菌約占60%[2-3]。為探討肺炎鏈球菌的耐藥表型、耐藥機制,本研究對184 株肺炎鏈球菌臨床分離株進行了研究。

1 材料與方法

1.1菌株來源 收集、復蘇本院2014年1月至2016年12月分離的184株肺炎鏈球菌菌株,已經剔除重復菌株。菌株來源于痰液標本120株,血液標本31株,膿液標本12株,分泌物標本11株,其他標本10株。

1.2菌株鑒定及耐藥分析 所有菌株均經過Vitek 2鑒定,用GP68卡做肺炎鏈球菌藥敏分析。藥敏結果判斷參考美國臨床和實驗室標準化協會(CLSI )2016年標準。檢測的抗菌藥物包括青霉素類(青霉素G、阿莫西林)、頭孢菌素類(頭孢曲松)、氟喹諾酮類(左氧氟沙星、莫西沙星)、糖肽類(萬古霉素)、碳青霉烯類(厄他培南、美羅培南)、大環內酯類(紅霉素)、氯霉素類(氯霉素)、惡唑烷酮類(利奈唑胺)、磺胺類(磺胺甲噁唑)、林可酰胺類(克林霉素))藥物及四環素。質控菌株為肺炎鏈球菌ATCC49619。用紙片擴散(K-B)法檢測大環內酯類和林可酰胺類藥物耐藥菌株表型,所用藥物為紅霉素和克林霉素,由OXOID (UK)公司提供。根據美國臨床和實驗室標準化協會(CLSI)2016判斷標準:紅霉素K-B法抑菌圈直徑>20 mm為敏感(S),16～20 mm為中介(I),<16 mm為耐藥(R)；克林霉素K-B法抑菌圈直徑>18 mm為S,16～18 mm為I,<16為R。MLSB型(大環內酯類、林可酰胺類藥物和鏈陽霉素B耐藥)指對紅霉素耐藥,對克林霉素中介或耐藥。M型(大環內酯類藥物耐藥)指僅對紅霉素耐藥,對克林霉素敏感。

1.3耐藥基因檢測 PCR方法檢測耐藥基因erm(B)、mef(A)。試劑盒由寶生物工程(大連)有限公司合成,具體檢測方法見李靜等[4]的報道。基因引物見表1。

表1 大環內酯類抗菌藥物耐藥基因檢測引物

注:F為上游引物；R為下游引物。

1.4統計學處理 微生物鑒定及藥敏數據使用WHONET5.6軟件導出,計數資料以例數或率進行描述統計。

2 結 果

2.1肺炎鏈球菌的藥敏情況 耐藥表型為MLSB型的菌株有172株(93.5%),未檢測到耐藥表型為M型的菌株,見表2。

表2 184株肺炎鏈球菌對常見抗菌藥物敏感性結果(%)

2.2肺炎鏈球菌的耐藥基因檢測 PCR分析結果顯示168株(91.3%)只含有erm(B)基因,3株(1.6%)只含有mef(A)基因,1株(0.5%)既含有erm (B )又含有mef(A)基因。所有耐藥表型為MLSB型的菌株均含有erm(B)基因,見表3。耐大環內酯類肺炎鏈球菌中,有89株(51.7%)對青霉素G耐藥,有23株(13.4%)對青霉素G敏感。

表3 184株肺炎鏈球菌的耐藥基因型

注：cMLSB為固有耐藥；iMLSB為誘導耐藥。

3 討 論

細菌耐藥是指細菌對藥物的敏感性下降或者藥物對細菌無作用,此時往往需要聯合多種藥物進行治療。隨著藥物的聯合應用,多重耐藥菌也隨之增多。本地區肺炎鏈球菌對紅霉素耐藥率為93.3%,對克林霉素耐藥率為100.0%,高于文獻[5]報道的74.9%和71.7%。對四環素耐藥率為87.4%,略微高于林倍州等[6]報道的廣東地區的78.9%。四環素耐藥基因與erm基因可能存在于同一轉座子,因此,肺炎鏈球菌產生紅霉素耐藥性的同時可能產生四環素耐藥性[7]。本研究結果顯示,肺炎鏈球菌對萬古霉素、利奈唑胺的敏感率為100.0%,對左氧氟沙星與氯霉素的敏感率也在95.00%以上。本研究結果顯示,本地區大環內酯類藥物對肺炎鏈球菌感染的治療幾乎無效。根據肺炎鏈球菌對紅霉素與克林霉素的耐藥性可分為不同的耐藥表型[8],即MLSB型與M型。MLSB型又可分為cMLSB型(固有耐藥,即對紅霉素與克林霉素均耐藥)和iMLSB型(可誘導耐藥,即對紅霉素耐藥,對克林霉素抑菌圈減小,出現D環現象)。MLSB型是由erm(B)和(或)mef(A)基因引起。M型僅對紅霉素耐藥,對克林霉素敏感,只是由mef(A)基因引起。本研究中耐藥表型為MLSB型的菌株有172株,其中cMLSB型有165株,iMLSB型有7株,耐藥表型為M型菌株有0株。

肺炎鏈球菌對大環內酯類耐藥的主要耐藥機制包括:核糖體作用位點的改變,主動外排機制增強,編碼核糖體蛋白L4、L22和(或)rRNA235的基因變異等[9]。由erm(B)編碼rRNA235的甲基化,導致出現MLSB表型。根據甲基化基因的上游調節序列的不同[10],MLSB表型可分為cMLSB型和iMLSB型。MLSB型對大環內酯類藥物高水平耐藥(MIC≥64 mg/L)。大環內酯類藥物泵外排基因mef于1996年被發現,主要包括mef(A)(最早發現于化膿鏈球菌)和mef(E)(最早發現于肺炎鏈球菌)。mef(A)和mef(E)在肺炎鏈球菌中非常常見。研究表明mef(A)外排泵的特異性底物是十四元環和十五元環大環內酯類藥物,mef調節的大環內酯類藥物耐藥表型是M型[11]。M型通常對大環內酯類藥物低水平耐藥(MIC為1～32 mg/L)。

本研究中erm(B)基因檢出率為91.3%,說明由erm(B)編碼的cMLSB耐藥表型是中山地區的主要表型。mef(A)基因的檢出率為1.6%,但未能檢測出M表型,這是因為由mef(A)介導的低水平耐藥被由erm(B)介導的高水平耐藥掩蓋所致[12]。

有報道稱,mef(A)和erm(B)基因的流行有明顯的地域差異,也可隨時間、年齡不同而變化[13]。本研究結果與成都[14]、溫州[15]等地區的報道不同,也可能是樣本量太小或者入選人群不同而產生的偏倚所致。 進一步研究應當加大樣本量,增加入選人群,并動態監測耐藥率與耐藥基因的變化以更好地了解肺炎鏈球菌在本地區的流行情況。

綜上所述,本地區肺炎鏈球菌對紅霉素與克林霉素的耐藥率較高；耐藥表型以erm(B)編碼的cMLSB耐藥表型為主,主要以靶位點的修飾為主,也與泵外排機制有關,耐藥基因有地域差異。由于各地區醫療環境、抗菌藥物使用習慣等的不同,導致肺炎鏈球菌對紅霉素與克林霉素的耐藥基因型和耐藥表型檢出率有地域差異,因此需要積累數據,動態監測當地耐藥菌株流行情況,協助臨床合理使用抗菌藥物,控制耐藥率。