激光人工皺縮對單囊胚解凍后移植結局的影響*

段如冰，梁曉東，梁輝洪，婁 娟，郭江華

廣東省江門市中心醫院生殖醫學診療中心，廣東江門 529000

近三十年來，人類生殖醫學是發展最快、最活躍和最富有成果的學科之一。由于環境污染、過度晚婚晚育等因素，人類的生育力呈下降趨勢，不孕不育的發病率逐年上升[1-2]。胚胎質量是影響臨床治療不孕癥結局的重要因素之一，將卵裂期胚胎繼續培養至囊胚階段能獲得更高的種植率[3-4]，故囊胚冷凍技術對治療不孕癥結局尤為重要。單囊胚移植可以有效降低多胎率[5-6]，降低胎兒和產婦的風險，是移植策略的必然趨勢。囊胚腔中液體較多，冷凍保護劑不能充分滲透到細胞內，導致冰晶形成，進而損傷細胞[7]。基于激光的人工皺縮技術能在囊胚玻璃化冷凍前使囊胚腔塌陷，避免了由冰晶引起的細胞冷凍損傷。但是激光人工皺縮對單個囊胚玻璃化冷凍后的發育潛能的影響尚未闡明。本研究采用回顧性隊列研究，探討單個囊胚經激光人工皺縮后行玻璃化冷凍-解凍對移植結局的影響，為單囊胚解凍移植策略提供理論參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2011年12月至2018年12月在廣東省江門市中心醫院生殖醫學診療中心就診的508例不孕癥女性為研究對象。納入標準：(1)體外人工授精(IVF)/卵胞漿內單精子注射(ICSI)患者，年齡<39歲。(2)遵醫囑及患者意愿行囊胚培養，所得到囊胚經玻璃化冷凍保存。(3)囊胚解凍后移植1個囊胚的患者。(4)觀察周期均為第一次取卵周期。(5)患者對本研究充分知情同意，自愿參與，并簽署知情同意書，且允許其數據被匿名用于臨床科學研究。排除標準：(1)供卵、移植前基因診斷(PGD)/移植前基因篩查(PGS)、卵子體外成熟(IVM)的周期。(2)經皮睪丸精子抽吸術(TESA)/經皮附睪精子吸取術(PESA)來源的精子授精后獲得的囊胚。

本研究為回顧性隊列研究，研究對象分為皺縮組和對照組，皺縮組患者的囊胚采用激光打孔皺縮后再玻璃化冷凍(222例)；對照組患者的囊胚未行皺縮直接玻璃化冷凍(286例)。

1.2方法

1.2.1控制性超促排卵與囊胚評分 控制性超促排卵按本中心常規操作進行[8]。患者胚胎在37 ℃、6%CO2、5%O2的環境中，用G-1和G-2培養液(Vitrolife，瑞典)進行序貫培養，根據胚胎和患者情況決定第3天或第5天移植。第3天移植或冷凍后剩余的胚胎經患者知情同意后行囊胚培養。分別于第5天、第6天觀察，采用 Gardner評分方法對囊胚進行評分；將移植完剩余的符合冷凍標準的囊胚進行冷凍保存。移植或者冷凍保存的囊胚標準：≥3期，內細胞團或滋養層細胞至少有1個在C級以上，不包括內細胞團細胞及滋養層細胞均為C級者。子宮內膜準備包括自然周期、激素替代周期和促排卵周期3種方案。

1.2.2激光打孔皺縮囊胚 皺縮組在囊胚冷凍前進行激光打孔，使擴張囊胚皺縮。具體過程如下：采用RI激光破膜系統(Saturn Active，英國)對擴張囊胚行激光打孔，使用單一的激光照射(409 μs)滋養細胞較薄弱區(遠離內細胞團)打孔，囊腔迅速皺縮，水分流出，囊胚放回培養箱中，5～10 min后囊胚腔完全收縮，立即使皺縮的囊胚玻璃化冷凍，并儲存在—196 ℃液氮罐中。對照組囊胚直接行玻璃化冷凍。

1.2.3囊胚冷凍與復蘇 皺縮組與對照組囊胚冷凍、解凍試劑均選擇日本Kitazato冷凍及解凍試劑盒，操作方法參照其說明書[9]。

1.3觀察指標 (1)比較兩組患者的優胚率，將囊胚發育至≥3期，內細胞團和滋養層細胞均≥B級定義為優質囊胚；(2)比較兩組患者臨床妊娠率、生化妊娠率、種植率、流產率及異位妊娠率。移植12 d后查患者血、尿人絨毛膜促性腺激素(HCG)，若呈陽性且第35天行超聲檢查見到孕囊，并有心管搏動則判定為臨床妊娠。

2 結 果

2.1兩組患者臨床資料比較 兩組患者的年齡、不孕年限、內膜厚度及內膜準備方案等比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.2兩組患者移植結局比較 兩組患者的臨床妊娠率、優質囊胚率、生化妊娠率、種植率、流產率和異位妊娠率，差異均無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表1 兩組患者臨床資料比較

表2 兩組患者移植結局比較

3 討 論

影響囊胚玻璃化冷凍的因素很多，如冷凍前囊胚的選擇、冷凍載桿、人工皺縮、輔助孵化及復蘇后擴張速度等[10-11]。既往研究顯示，囊胚腔大小與冷凍復蘇后的囊胚存活率呈負相關，因為囊胚腔內含有大量液體，若脫水不充分易形成細胞內冰晶，造成胚胎冷凍損傷[12]。DESAI等[13]的研究顯示，皺縮組與未處理組在存活率、復蘇率上差異無統計學意義(P>0.05)，皺縮組僅在復蘇后囊胚的擴張速度上較快。本研究也顯示，皺縮組的臨床妊娠率、優質囊胚率、生化妊娠率、種植率、流產率、異位妊娠率與對照組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。這可能與商業化的玻璃化冷凍體系日漸成熟有關(細胞脫水置換充分、冷凍載桿薄、降溫迅速)。

由于激光人工皺縮技術在臨床上應用的時間較短，尚無大量的隨訪數據證明其對子代圍生期和新生兒結局是否存在影響；且未經皺縮的囊胚冷凍復蘇后也能達到理想的妊娠結局，故建議在單囊胚凍融移植中將不經人工皺縮的玻璃化冷凍作為患者的首選方案。需要指出的是，由于本研究是在單中心數據上進行的，故上述結論仍需要更大樣本量的多中心研究進行證實。