水稻兩系窄葉突變體Fz1S的表型分析與基因定位

馮 慧，吳孝波，黃 強，肖 梅，劉育生，楊成明

(四川省原子能研究院，四川 成都 610101)

【研究意義】隨著人口數量的不斷增加，據預測到2035年，水稻總產量要提高26 %才能滿足現在人口數量的增長[1-2]。因此，提高水稻產量仍然是未來水稻育種的最為重要的目標之一。水稻株型是決定水稻產量的重要因素，葉形改良是超高產理想株型育種的重要研究內容。倒三葉空間分布合理化，就會優化個體和群體受光姿態，從而提高光合效率，促進水稻增收增產[3]。袁隆平院士提出了超高產雜交稻的理想株型模式[4]，強調倒三葉“長、直、窄、凹、厚”；即倒三葉要修長(50 cm)，挺直，窄凹較厚，株型緊湊。因此，開展水稻窄葉突變體研究對高產育種及株型育種具有重要意義。 【前人研究進展】通過輻射誘變、EMS 誘變和 T-DNA 插入突變的方式，已經獲得了大量的可穩定遺傳的窄葉突變體種質資源。目前為止，已經定位37個水稻窄葉相關基因，這些窄葉基因大部分為隱性突變體基因，只有 Dnal1 為顯性突變體基因[5]。通過對目前克隆窄葉基因分析發現，這些窄葉基因的分子機理主要涉及到生長素、纖維素酶、microRNA、細胞分裂、轉錄因子等方面。NAL1編碼一個基因編碼絲氨酸/半胱氨酸蛋白酶，基因突變導致生長素極性運輸缺陷，維管束數量減少，從而導致水稻葉片變窄[6-8]。NAL2 和 NAL3 編碼WUSCHEL 相關的同源框蛋白 OsWOX3A 轉錄激活因子，控制生長素極性運輸基因的表達[9]。NAL7 編碼一個含核黃素的單加氧酶，是YUCCA家族中的一員，調節生長素的生物合成，從而導致水稻變窄卷曲[10]。窄卷葉基因 NRL1 (NARROW AND ROLLED LEAF 1)編碼一個纖維素合成類似酶 OsCSLD4，該基因能夠通過影響維管束和泡狀細胞的發育來調控葉片的寬度和卷曲度[11-13]。NL7突變體窄葉編碼 DnaJ 蛋白， NL7是一個功能喪失突變體，NL7突變導致葉片維管束數目減少，從而水稻葉片寬度降低[14]。TDD1編碼鄰氨基苯甲酸合成酶β亞基，參與色氨酸依賴的植物生長素合成[15]。傳統的基因定位采用構建精細群體以及連鎖分析的圖位克隆方法，構建的遺傳圖譜大多是以PCR標記為基礎的，比如常用的以SSR標記為基礎的遺傳圖譜。隨著測序技術的發展，通過對群體材料重測序從而構建出高密度、高精度的遺傳圖譜已成為基因挖掘和克隆的有效途徑。MutMap方法是在NGM棊礎上提出的-種新的BSA的分析方法，該方法通過將誘變的突變體與親本雜交構建F2代分離群休，并直接對F2代群體中的突變型池進行深度測評，然后將突變型池獲得的重測序結果與親本基因組序列進行比對，引入SNP-index，將突變體的候選基因限定在一個可靠地范圍內進行篩選，從而成功記位導致突變的基因[16]?！颈狙芯壳腥朦c】本研究利用電子束輻照誘變深08S篩選到的水稻窄葉突變體，命名為輻窄1S(Fz1S)，對其進行了表型鑒定、細胞學觀察、遺傳分析和基因定位?！緮M解決的關鍵科學問題】為窄葉基因的克隆和功能分析奠定了良好基礎, 也為水稻株型改良提供了基因資源和育種材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

利用通過電子束輻照誘變深08S，經6代種植，2015年冬天在海南島發現在突變體里有窄葉突變體，40株小群體里有9株窄葉突變體，經多代自交，其窄葉性狀能夠穩定遺傳，命名為輻窄1S(Fz1S)。

1.2 突變體的表型鑒定

在水稻抽穗期分別統計輻窄1S(Fz1S)和其野生型深08S劍葉、倒二葉的長和寬(葉片展開時最寬處),成熟期測定其株高，稱量千粒重，測量粒長和粒寬,分別隨機選取10株測定各性狀，取平均值，試驗數據采用SPSS 9.0進行方差分析。

1.3 細胞學觀察

在水稻抽穗期分別取輻窄1S(Fz1S)和其野生型深08S的新鮮葉片劍葉5片，徒手切片，用FAA固定液體(70 %乙醇90 mL、40 %甲醛5 mL、和冰醋酸5 mL)固定，經脫水、透明、石蠟包埋。用番紅、固綠染色，在麥克奧迪的BA200Digital數碼三目攝像顯微攝像系統下觀察、照相。并統計葉片大、小維管束數目。

1.4 遺傳分析

以輻窄1S(Fz1S)為母本，深08S，恢復系R5894(R3799/R838-8/香183/成恢727)、R2928、R1813、五山絲苗、R1928為父本,配制雜交組合,觀察 F1代表型并收獲F1單株種子，F1自交獲得 F2代種子。F2群體按單株插秧，在抽穗期統計正常和窄葉突變個體的株數，用于遺傳學分析，確定窄葉突變的遺傳規律。

1.5 基因定位

輻窄1S(Fz1S)與深08S采用CTAB法分別提取DNA，建立親本池。輻窄1S(Fz1S)與深08S雜交 F2分離群體中與窄葉突變體性狀相同單株 30 株，采用CTAB法分別提取DNA，將 DNA 等量混池，建立子代突變池。參考Illumina Paired-End DNA Sample Prep Kit 方法建庫。采用Illumina X-TEN平臺進行高通量測序。各樣本的測序數據經過數據質控，過濾接頭序列及低質量的序列片段。將野生型親本深08S、輻窄1S(FZ1S)的測序 reads 通過SOAP2 軟件比對到參考基因組(蜀恢498_IGDBv3)，篩選出比對唯一位置的reads。利用SOAPsnp軟件尋找蜀恢498參考基因組與突變體間的SNP。將蜀恢498參考基因組上的SNP位點替換成野生型親本對應位置的堿基，獲得親本的參考基因組。采用同樣的方法測序并分析子代突變池重測序數據,得到子代突變池與蜀恢498之間的SNP位點。然后將子代突變體池/蜀恢498 SNP 與深08S/蜀恢498 SNP 相比較,去掉突變體池中與野生型相同基因型的SNP 位點后,并根據野生型深08S index ≥0.8以及覆蓋到該位點的reads≥5 進行篩選。計算篩選剩下的位點的SNP index 值，并將所有篩選剩下的位點在染色體上作圖。理論上,造成突變性狀的突變位點SNP index 應該等于1，即為純合位點；由于遺傳連鎖，其附近的SNP 位點index 應該等于或接近1。尋找在染色體上成簇分布的SNP 位點，再根據突變位點對所在基因的影響加以判斷, 確定用于實驗驗證的突變位點[17]。

2 結果與分析

2.1 突變體的表型鑒定

與野生型深08S相比，輻窄1S(Fz1S)的窄葉性狀在抽穗期劍葉寬度平均變窄69.89 %、倒2葉的寬度平均變窄80.26 %，均極顯著變窄；劍葉長度平均變短41.27 %、倒2葉的長度平均變短65.56 %，均極顯著變短；主穗長平均變短33.35 %，極顯著變短；成熟期株高平均變矮25.49 %，極顯著變矮；千粒重降低5.55 %，極顯著降低；粒長和粒寬沒有顯著變化。結果表明：水稻窄葉突變基因(Fz1S)對其劍葉和倒2葉葉寬、葉長、主穗長、株高、千粒重的表型有顯著或極顯著影響(表1，圖1)。

2.2 細胞學觀察

葉片的組織結構觀察(表2，圖2)表明，抽穗期時劍葉中部橫切面與野生型深08S相比，輻窄1S(Fz1S)的大維管束約減少20.97 %，顯著(P<0.05)變少、小維管束約減少45.3 %，極顯著(P<0.01)變少，其中小維管束數目的減少幅度比大維管束更明顯。

表1 深08S和輻窄1S(Fz1S)的農藝性狀

圖1 輻窄1S(Fz1S)與野生型深08S的表型鑒定

ShenS.深08S，Fz1S.輻窄1S，LV.大維管束，SV.小維管束

表2 輻窄1S (FZ1S)與野生型深08S劍葉大維管束和小維管束數目

表3 窄葉突變體Fz1S的遺傳分析

2.3 遺傳分析

將窄葉突變體分別與 5 個葉片寬度正常的恢復系R5894(輻恢3799/輻恢838-8/香183/成恢727)、 R2928、R1813、R1928、五山絲苗和野生型兩系深08S雜交，結果表明：所有雜交組合 F1葉片寬度與正常親本葉寬一致，說明該基因為隱性細胞核遺傳。所有雜交組合 F2群體均發生性狀分離。5個恢復系及野生型兩系深08S與窄葉突變體雜交，F1葉片表型正常，F2出現正常表型和窄葉表型 2 種表型，其分離比例均符合 3∶1，說明該突變體基因為隱性核單基因突變(表3)。

2.4 基因定位

重測序獲得 reads 數進行過濾，親本深08S、輻窄1S(FZ1S)、F2代子代突變池，分別獲得84221020、 124162046和75325658條resds。親本深08S、輻窄1S(FZ1S)、F2代子代突變池Q20分別為97.34 %，97.25 %，97.65 %，親本深08S、輻窄1S(FZ1S)、F2代子代突變池GC含量分別為43.01 %，43.80 %，42.96 %。各樣本的測序數據經過數據質控，過濾接頭序列及低質量的序列片段。采用SOAP2軟件將所有測序數據比對到參考基因組上(蜀恢498-IGDBv3)，獲得測序覆蓋度，所有樣本的比對率都介于 95.5 % 和 97.83 % 之間，對參考序列 >=10X的覆蓋度介于82.53 % 到84.32 % 之間，由此判斷各測序樣品與參考序列有較高的同源性。各樣本平均測序深度在29.13 與 36.36 之間浮動，能夠滿足后續 MutMap分析要求。2個親本的reads比對率都在94 %以上，滿足后續的分析。根據重測序數據分析，8號染色體大致在4.9～5.3Mb的區域可能為候選基因區(圖3)。

3 討 論

兩系法雜交水稻已經歷了30多年的研究歷史，1996-2014年，中國有900多個兩系法雜交水稻品種通過審定, 目前年推廣面積約550萬公頃左右，累計推廣面積約5000萬公頃，占全國雜交水稻播種面積的35 %左右，已經成為水稻雜種優勢利用的主要途徑。兩系法雜交水稻的發展為我國的糧食安全起到了重要作用。兩系法雜交水稻的優點是配組自由、育種程序簡化、育種周期縮短、不育系多樣化。目前水稻窄葉突變體大部分是恢復系或常規稻，本研究窄葉突變體是通過輻射誘變獲得的首個水稻窄葉突變體光溫敏核不育系，該突變體較親本深08S葉片變窄、植株變矮，千粒重降低，但粒長和粒寬沒有顯著變化。該窄葉突變體Fz1S可以直接選育兩系雜交稻品種，也可以間接作為育種親本用于選育出水稻三系雜交稻新組合、常規稻新組合、新材料、新品種。

圖3 各SNP位點SNP index 在水稻染色體上的分布情況

突變體是快速進行基因定位和克隆的重要材料，隨著高通量測序技術的發展，基因組測序己經成為鑒定突變基因的最便捷的手段。MutMap方法是基于簡化基因組測序的一種基因克隆的新方法，對比傳統構建精細群體以及連鎖分析的圖位克隆方法，MutMap方法擴大了測序定位基因的應用范圍，縮短了時間，節約了成本。本研究通過輻射誘變獲得窄葉突變體光溫敏核不育系，并利用MutMap技術對該窄葉基因進行定位，為更好克隆窄葉突變基因分析突變基因的功能以及水稻葉片葉形發育的分子機制奠定理論基礎。

在本研究中，通過構建輻窄1S(Fz1S)分別與5個恢復系和野生型兩系深08S雜交F1、F2群體并進行遺傳分析，結果表明：窄葉突變體輻窄1S(Fz1S)的突變性狀受 1 對隱性基因控制，窄葉突變體輻窄1S(Fz1S)除表現為劍葉、倒2葉葉片變窄，還伴隨著矮稈、小穗等性狀。窄葉突變體輻窄1S(Fz1S)可能與其它窄葉基因一樣，同時控制多個性狀，存在一因多效的現象。目前已經報道的37個窄葉基因窄葉基因分布在除 6號、11 號染色體外其他10條染色體上，其中 18個基因已經克隆。基因OsCCC1導致植株葉片變窄、矮稈、莖短、產量降低、根長變短，基因定位在8號染色體，14.27 Mb的區域。本研究利用 Mutmap 測序定位窄葉突變基因Fz1S，結果表明突變基因可能位于8號染色體，大致在4.9～5.3 Mb的區域。因此，本研究所定位的窄葉突變基因Fz1S可能是一個新的窄葉基因，基因初步定位結果為后續的候選基因發掘、基因克隆以及功能分析打下了良好的基礎。