免疫熒光染色切片改染HE 的方法探討

高洪彬，梁十，郭揚清，吳玉娥，賈歡歡，劉嬋，李云峰，李航，王希龍，陳梅麗

（省實驗動物監測所；廣東省實驗動物重點實驗室，廣東 廣州）

0 引言

免疫熒光檢測技術具有專一性強、靈敏度高、實用性好等優點[1]，目前得到大量應用。但有時由于某些原因，免疫熒光切片未有相應的HE 染色切片可比較分析，即使有HE 切片但由于不為同一組織片、需要觀察的位置已經或多或少的發生了改變，不利于與免疫熒光切片進行精準的比較研究。本研究通過實踐，探討了免疫熒光染色后進行HE 染色的方法，并對方法進行了比較分析。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

[普通級]食物蟹猴3 只，由廣東春盛生物科技發展有限公司提供[SCXK（粵）2014-0027]，實驗動物及實驗方案均得到了動物關懷與使用倫理委員會的批準。動物飼養場所嚴格按國際實驗動物評估及認證管理委員會規定和要求對實驗動物進行日常飼養、關懷和管理。

1.2 儀器與試劑

主 要 儀 器：Leica DM3000 正 置 熒 光 顯 微 鏡，Leica ST5020+SV5030 全自動染色封片一體機，Leica RM2255 全自動輪轉切片機，Leica EG1150H+C 石蠟包埋機，Leica TP1020 全自動脫水機。

主要試劑：胰島素抗原（Gene Tex 公司）、熒光二抗（Invitrogen Life Technologies 公司）PBS 緩沖液（博士德生物工程有限公司）、免疫染色封閉液（碧云天生物技術有限公司）、無水乙醇（廣州中南化學有限公司）、95%乙醇（廣州凱秀貿易有限公司）、胰蛋白酶（南京建成生物工程研究所）、1%醇溶性伊紅（廣州凱秀貿易有限公司）、Harris 蘇木素（廣州凱秀貿易有限公司）、二甲苯（天津市百世化工有限公司）、TO 透明劑（廣州市中南化工儀器有限公司）、丙三醇（天津市致遠化學試劑有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 組別

選取3 只血糖正常的食蟹猴胰腺蠟塊標本，連續切片后多聚賴氨酸防脫玻片撈片，分3 組，每組3 個蠟塊，即：空白切片染HE組（A 組），高壓修復免疫熒光切片染HE 組（B 組），胰蛋白酶修復染HE 組（C 組）。A 組直接進行HE 染色；B 組使用高壓加熱修復抗原的方法進行免疫熒光染色，已完成熒光染色的切片進行HE染色。C 組使用胰蛋白酶修復抗原的方法進行免疫熒光染色，已完成熒光染色的切片進行HE 染色。

1.3.2 免疫熒光染色方法

空白切片烤片，二甲苯脫蠟，梯度酒精水化后PBS 沖洗3 次、每次5min，高壓加熱修（高壓鍋噴氣后5min 停止加熱，待自然冷卻至室溫）或1.25%胰蛋白酶修復（37℃，30min），PBS 沖洗(3 次、每次5min)，熒光封閉液封閉60min，一抗孵育（4℃冰箱過夜），復溫（37℃，60min），PBS 沖洗(3 次、每次5min)，二抗孵育（37℃，60min），PBS 沖洗(3 次、每次5min)，晾干，封片。

1.3.3 HE 染色方法

空白切片在二甲苯I 及二甲苯II 中分別浸泡20min 脫蠟梯度酒精脫水至純水，每個步驟7min。接著進行Harris 蘇木素染色10min，再放入水中浸泡1min，1%鹽酸乙醇分化5s，流水返藍15min。轉移至90%乙醇浸泡7min，1%醇溶性伊紅染色30s，轉移至95%乙醇I、95%乙醇II 以及95%乙醇III 各浸泡10s，然后至無水乙醇I、無水乙醇II 脫水各5min，最后在TO 透明劑 I、TO透明劑II 各浸泡7min，封片。

已完成熒光染色的切使用PBS 泡洗（3 次，5min），脫去蓋玻片及封片劑后流水沖洗30min。后續進行Harris 蘇木素染色等與空白切片相同的程序和步驟。

1.3.4 病理組織學觀察

使用顯微鏡進行組織學觀察。B、C 組在染HE 前在熒光顯微鏡下進行觀察和拍照，不同組不同動物的熒光染色和HE 染色切片使用同一光線亮度及照片采集軟件參數下進行閱片和拍照。

2 結果

胰腺由外分泌部和內分泌部組成。外分泌部由胰腺腺泡組成，內分泌部由胰島組成。

A 組3 例組織切片均平整，組織細胞結構清晰，色彩深淺適度，紅藍對比鮮明，著色層次清晰，色調柔和悅目，綜合評估染色效果佳。B 組有1 例切片部分組織破損脫落，2 例平整，3 例各指標染色效果與A 組相當，綜合評估染色效果佳與A 組相當。C 組3 例組織切片均平整，組織細胞結構清晰，紅染偏淡，紅藍對比較鮮明，著色層次較清晰，色調柔和較悅目，綜合評估染色效果尚可、但較A、B 組稍差。染色效果見下圖①-⑤。

3 討論

免疫熒光是組織病理學研究的常用實驗技術[2]，石蠟切片在進行免疫熒光染色時進行的處理包括有機溶劑脫蠟、梯度酒精水化、PBS 泡洗、抗原修復、熒光封閉液封閉、一抗孵育、二抗孵育及封片等操作[3，4]。組織細胞內嗜酸性成分結合伊紅顯示紅色、嗜堿性物質結合蘇木素顯示藍色[5]，由于整個實驗過程未接觸強酸強堿性等可改變組織成分酸堿度的溶劑，而PBS 溶液的使用能夠對可能的組織細胞成分酸堿度的改變起到緩沖調節作用，因而理論上進行了免疫熒光染色的切片可以進行HE 染色且顯色正常。免疫熒光切片的封片劑常使用有抗熒光淬滅作用的丙三醇PBS 溶液[6]，由于丙三醇溶于水[6]，故使用PBS 溶液浸泡除去蓋玻片、流水沖洗去除組織上殘留的封片劑。

本實驗觀察到免疫熒光切片，按常規HE 染色的方法和程序進行染色即可得到較理想效果。B 組有的切片可見組織破碎、脫落，該切片在進行HE 染色之前已經是有相應的區域破碎、脫落，組織塊的破損主要是發生在進行免疫熒光染色抗原的高壓熱修復過程[7]。進行HE 染色前組織平整的切片，進行HE 染色后未發現脫落現象。實驗發現高壓修復免疫熒光切片續染HE 組的染色效果理想，染色效果和空白組織切片直接進行HE 染色的效果相當。C 組HE 染色效果尚可，可以進行組織病理學觀察，但染色效果較差，主要表現為伊紅染色效果較差，這可能是在進行免疫熒光時使用胰酶對抗原進行修復的同時組織細胞的其它蛋白質成分也被或多或少的消化[8]，由于蛋白質嗜伊紅，所以HE 染色效果體現出伊紅染色的不足。

圖1